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荧光原位杂交实验具体步骤及方法

用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

1.?探针变性

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将探针在75℃恒温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。

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2.?标本变性

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（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。?

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（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2xSSC的变性液中变性2～3min。?

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（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。

3.?杂交

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将已变性或预退火的DNA探针10uL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

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4.?洗脱

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此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

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（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。?

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（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5min。?

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（3）在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5min。?

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（4）在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。?

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（5）取出玻片，自然干燥。?

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?（6）取200uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

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5.?杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）

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（1）在玻片的杂交部位加150uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。?

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（2）去掉保鲜膜，再加150uLavidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。?

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（3）取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。?

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（4）在玻片标本的杂交部位加150uL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20min。

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（5）去掉保鲜膜，加150uLantiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。?

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（6）取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。?

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?（7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于2xSSC中室温清洗一下。?

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?（8）取出玻片，自然干燥。?

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?（9）取200uLPI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

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6.?封片

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可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

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7.?荧光显微镜观察FISH结果

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先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。

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注意

相关溶液的配制

1.20×SSC：175.3gNaCl，88.2g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/LNaOH调pH至7.0）。

2.去离子甲酰胺（DF）：将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中。电磁搅拌30min，用Whatmanl号滤纸滤。

3.体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL20×SSC，10mL水。

4.体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL20×SSC，80mL水。

5.体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

6.杂交液：8μL体积分数25%DS，20μL20×SSC混合。（或40μL体积分数50%DS，20μL20×SSC，40μLddH2O混合）取上述混合液50μL，与5μLDF混合即成。其终浓度为体积分数10%DS，2×SSC，体积分数50%DF。

7.PI/antifade溶液

PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100μg/mL，取出1mL，加39mL双蒸水，使终浓度为2.5μg/mL。Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10