色谱分析(中国药科大学)第4章第1-6节高效液相色谱分析.docVIP

高效液相色谱法

第一节概述

一、定义与分类

液相色谱是指流动相为液体的这类色谱法的总称。高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，简称HPLC），是一种在经典液相色谱基础上发展起来的实用、快速，高效及高灵敏度的分离分析方法。

根据固定相的不同，HPLC可分为以下几类：

液－固吸附色谱法

液－液分配色谱法

化学键合相色谱法

离子交换色谱法

离子对色谱法

凝胶色谱法（又称分子筛色谱法，分子排阻色谱法，尺寸排阻色谱法）

二、HPLC的特点和其它色谱法的比较

（一）与经典液相色谱比较

高分离效能

H=A+B/u+Cu(A=2dp，C与dp2呈线性关系，dp↑→C↑，A↑)

经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。

快速，省时，省材料

经典柱色谱中的柱子多为一次性使用，且体积大（0.1～2m长，0.5～5cm粗），分离速度慢（几小时～几周），每次均要重新装柱，造成人力，物力及时间上的浪费，而一根HPLC柱能重复使用数百次，此外，由于配备了高压输液泵可实现快速分析。

灵敏度高，准确度高，可达1％的分析精度

柱色谱及薄层色谱（TLC）在进行定量分析时影响因素较多，故准确度及重现性均不如高效液相色谱。

HPLC与经典液相色谱的比较

高压，2-20MPa

柱口压力低,0.001～0.1

2-5

100

/m

2000-50000

2-50

分析速度快

分析速度慢

可重复多次使用

色谱柱只用一次

能在线检测

不能在线检测

好

（二）与GC比较

适合于热不稳定性样品的分析

GC中使用气体为流动相，要求被测样品在气化室高温气化后方可在柱上分离，这就使得热不稳定性样品用GC分析比较困难，需衍生化以保护被测物的不稳定基团

有利于有机酸，碱等极性化合物的分离

这些物质用GC直接来测定时，由于有较大的极性，一方面易产生托尾的现象，另一方面，保留时间过长，因而测定困难，需利用衍生化来减小其极性后方可GC分析

可分离离子型化合物及蛋白质，肽类等大分子化合物

这些物质无法气化，不可GC分析。

总之，HPLC与GC各有所长，互相补充，均成现代分析中不可缺少的工具。

HPLC与GC的比较

挥发性物质，适用于20％的化合物

几乎可以分析各种物质

对热不稳定的物质不能分析

可以用于热不稳定的物质

用毛细管柱色谱可得到很高的柱效

色谱柱不能很长，柱效不会太高

载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性

固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性

回收困难

可定量回收，可用于制备

第二节液－固吸附色谱及液－液分配色谱

一液－固吸附色谱（LSC）

定义

色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normalphasechromatography，NPC）。

液－固吸附色谱是最早出现的，也是最基本的一种柱色谱类型。在吸附色谱中，样品组分（溶质）受到两种力的作用，一是固定相对它的吸附力，二是流动相的“拉力”或溶解力，即溶质处于这两相作用力场的平衡之中。吸附力强而溶解能力差时，溶质有较大的保留；反之，则较先流出色谱柱。溶质，吸附剂和流动相溶剂分子三者间的相互作用，涉及偶极之间的诱导力，静电力，氢键力，色散力，电荷转移或∏络合物形成等相互作用类型。在氧化物型极性吸附型上，静电，诱导，氢键等特殊作用力为主要的作用力，色散力微不足道。但在非极性的固定相，例如多孔碳的情况下，非特殊的色散力是固定相与溶质分子间唯一的相互作用力。

（二）固定相

液—固吸附色谱固定相分类如下：

酸性吸附剂：硅胶、硅酸镁极性吸附剂

酸性吸附剂：硅胶、硅酸镁

极性吸附剂

极性碱性吸附剂：氧化铝、氧化镁

极性

碱性吸附剂：氧化铝、氧化镁

非极性吸附剂：活性碳

非极性吸附剂：活性碳

薄壳型（表面多孔层）：优点：传质快，渗透性好；

薄壳型（表面多孔层）：优点：传质快，渗透性好；

缺点：比表面积小，样品容量小（0.1mg/g）

缺点：比表面积小，样品容量小（0.1mg/g）

硅胶结构球形无定形全多孔型（表面多孔层）：

硅胶结构

球形

无定形

全多孔型（表面多孔层）：

优点：比表面积大，样品容量大（mg/g）

优点：比表面积大，样品容量大（mg/g）

HPLC中液—固吸附色谱固定相用的主要是硅胶。其次是氧化