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二、氧化氢酶的活性测定--高锰酸钾滴定法[原理]

过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。据此，可根据H202的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经过酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O25H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4

[仪器和用具]

研钵；三角瓶50ml4个；10ml酸式滴定管；恒温水浴锅；容量瓶25ml1个。[试剂]

10％H2SO4；0．2molL-1磷酸缓冲液;0．1molL-1高锰酸钾标准液；称取KmnO4(AR)克，用新煮沸泠却的蒸馏水配制成 1000ml,用草酸溶液标定； ：市售30％H202大约等于17．6m01L-1，取30％H202溶液5．68ml,稀释至于1000ml,用标准溶液（在酸性条件下）进行标定 草酸：称取优级纯用蒸馏水溶解后，定容至1L。

[方法]

酶液提取：取小麦叶片2．5g加入的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rmin-1离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

取50ml三角瓶4个(2个测定，2个对照)，测定瓶中加入酶液，对照瓶中加入煮死酶液，再加入，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10％

用L-1KMnO4标准溶液滴定H202，至出现粉红色(在30min内不消失)为终点。

结果计算：酶活性用每克鲜重样品1min内分解H202的毫克数表示：酶活（）=式中A--对照KMn04滴定毫升数(ml)

B酶反应后KMnO4滴定毫升数（ml）

VT 酶液总量（ml）;

V1 反应所用酶液量（ml）

W样品鲜重（g）的KMnO4相当于.

注意所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。三、过氧化氢酶的活性 紫外吸收法

[原理]

H202在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

[仪器与用具]紫外分光光度计；离心机；研钵；容量瓶250ml1个；刻度吸管支；2ml1支；10ml试管3支；恒温水浴锅。

[试剂]

L-1pH7．8磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)；0．1molL-1H202(用0．1molL-1高锰酸钾标定)。

[方法]

酶液提取称取新鲜小麦叶片或其他植物组织0．5g，置研钵中，加入2-3ml4℃下预冷的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用。

测定取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表42-2顺序加入试剂。25℃预热后,逐管加入的H2O2，每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按式42-3计算酶活性。

结果计算以1min内A240减少0．1的酶量为1个酶活单位(u)。过氧化氢酶的活性（）=

式中Aso--加入煮死酶液的对照管吸光值；As1,As2-样品管吸光值；

Vt--粗酶提取液总体积(ml);V1--测定用粗酶液体积(ml);

FW--样品鲜重(g);0．1-A20每下降0．1为1个酶活单位(u);t-加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。

注意:凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

【思考题】

1、影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？

2、过氧化氢酶与哪些生化过程有关

参考文献【1】MukherjeeSP,ChoudhuriM ofglycoalteoxidaseactivetyH2O2contentandcatalase (58):167-170

【2】蒋明义，郭绍刚，渗透胁迫下稻苗铁催化的膜脂过氧化作用.植物生理学报.(1):6-12

【3】林植芳，李双顺等.衰老叶片和叶绿体中H2O2的积累与膜脂过氧化的关系，植物生理学报.1998,14(1):16-22

【4】邹琦.植物生理生化实验指导.北京：中国农业出版社，1995

【5】【美】吉尔鲍