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三叶鬼针草中总黄酮提取工艺的研究

摘要

本文主要用乙醇浸提法探究三叶鬼针草中总黄酮的最佳提取工艺。试验主要分三部分，在第一部分的实验中，采用单因素实验的方法，在不同的提取时间、温度、料液比和乙醇浓度的条件下，确定提取因素的最佳水平；第二部分试验主要根据第一部分实验的结果，设计四因素三水平的正交试验，探究三叶鬼针草中总黄酮提取的最佳工艺条件。第三部分试验中，在最佳提取工艺条件下，分别对三叶鬼针草的地上部分、根部以及整株植株进行提取率的比较，探究不同植株部位总黄酮的含量，确定三叶鬼针草各部位的入药价值。通过本试验研究，确定采用乙醇浸提法提取三叶鬼针草中总黄酮的最佳提取工艺（料液比1:35、乙醇浓度70%、提取温度85℃、提取时间2小时），且在最佳提取工艺条件下，地上部分的总黄酮提取率（5.13%）大于根部总黄酮提取率（1.39%）。

关键词：三叶鬼针草；单因素试验；正交试验；总黄酮提取率

1引言

近年来，我国畜牧产业养殖方式正由传统的散户养殖向集约化、规模化养殖方式转变，我国养殖业进入飞速发展阶段，畜牧业产业经济增长迅速。但随着规模化程度加深，由于生产条件与生产规模之间的不协调，导致畜禽出现免疫力下降、抗生素药物滥用、疫苗效价低等种种问题。尤其是传染疾病问题，由于畜禽传染病较难发现，且传播速度快，往往会对养殖业造成重大损失，甚至严重者会危害人类健康。因此，提高畜禽免疫力，增强畜禽自身抗病能力成为了畜牧业养殖关键问题之一。植物提取物中，例如黄酮类、多糖类、皂苷类等，这些物质能够调节和改善家禽免疫系统。此外，植物提取物因其毒副作用低、相对价格较低、来源广泛等优点，逐渐受到养殖者们的重视。

三叶鬼针草属菊科鬼针草属植物，生长性能强，分布广泛。三叶鬼针草中富含黄酮类等成分。经研究发现表明

[2]，黄酮类化合物具有调节动物免疫系统和内分泌系统的效用，植物黄酮或类黄酮可以直接添加到家禽饲粮中使用，也可以作为禽类疫苗的免疫佐剂使用。两种方式均可提高免疫器官指数、家禽体内抗体水平、促进淋巴细胞分化与成熟，进而提高免疫性能。因此，利用三叶鬼针草中的黄酮类药物用于畜牧业养殖具有极大的经济价值。

在前人的研究中，关于三叶鬼针草中总黄酮提取工艺主要有煎煮法、浸提法、回流法、超声法和酶法。本试验以乙醇为溶剂，采用单因素试验和四因素三水平正交试验的方法，探究三叶鬼针草总黄酮提取的最佳工艺条件，为今后三叶鬼针草在饲料工业上的应用提供科学依据，并在最佳提取工艺条件下，分别测定三叶鬼针草不同地上部分总黄酮的含量，为最佳入药部分的选择提供理论依据。

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1中草药的制备

三叶鬼针草采自海南大学校内，分别摘取适量的地上部分、根部以及整株植株。然后将采摘的三叶鬼针草样本去除泥土、杂草等杂质后，洗净晾干，用剪刀剪成5cm左右长度，分散放于托盘中，置于烘箱中在60℃的条件下烘干7小时。烘干后的三叶鬼针草样本放于粉碎机中粉碎，将粉碎样本装入密封袋中并贴好标签，常温条件下储存备用。

2.1.2仪器与试剂

(1)仪器

烘箱、粉碎机、紫外分光光度计、冷凝管、水浴锅、电子分析天平、移液枪、漏斗、滤纸等。

(2)试剂

芦丁标准品、无水乙醇、氯化铝、氢氧化钠、亚硝酸钠均为分析纯。

2.2试验方法

2.2.1芦丁标准溶液配置

用分析天平精密称取芦丁标准品10.0mg，置于100ml容量瓶中，用70%的乙醇溶液溶解并稀释至刻度线，摇匀，备用。

2.2.2标准曲线的制作采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定总黄酮含量[3-4]，实验过程如图1所示。

图1芦丁标准溶液总黄酮含量测定流程

标准曲线如图2，并得到回归方程y=8.16x-0.0278（R2=0.993）。

图2芦丁标准曲线

2.2.3样品总黄酮含量的测定样品中总黄酮含量测定过程如图3所示。

图3样品中总黄酮含量测定过程

总黄酮含量(%)=(m1×稀释倍数×n)/10/W

其中：m1－浸提液中总黄酮浓度（mg·mL－1）；n－过滤样品后的定容体积，mL；W－样品质量，g。

2.2.4单因素试验

分别研究提取时间、温度、料液比、乙醇浓度对总黄酮提取率的影响，并确定各因素的最佳水平[6-9]。

(1)提取温度对总黄酮提取率的影响

用分析天平精确称取5份三叶鬼针草整株样本于圆底烧瓶中，每份1g（精确到0.0001g）→用70%的乙醇配制料液比为1:30的待测溶液→将水浴锅温度分别设置为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，依次将5个圆底烧瓶置于不同温度中回流提取2小时→趁热过滤得到初次过滤液→取10毫升初次滤液，加入0.1g碳粉并摇晃均匀，让碳粉充分吸附滤液中的叶绿素→第二次过滤，得到不含叶绿素的滤液→分别测定各待测样滤液中的总黄酮含量。

(2)提取时间对总黄