实验报告：-线虫RNA干扰的基因沉默.docVIP

实验一：线虫RNA干扰的基因沉默

实验目的

RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是一种使基因使失活的有效方法，在线虫中，RNA干扰因为简单而成为研究基因功能的有效手段。我们利用表达tag-214dsRNA的大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag-214基因功能的目的。

二、实验背景

RNAi是近年来以秀丽线虫的研究为基础而发展起来的一种基因knockdown技术，将体外合成的含有目的基因的dsRNA通过某种方式引入到线虫体内，导致其体内相应的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。

三、实验原理

通过显微注射dsRNA或者把线虫浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能够表达dsRNA的大肠杆菌喂食线虫，可以将dsRNA导入大肠杆菌中。在大肠杆菌HT115中，含有目的基因发夹结构的质粒，在IPTG的诱导下转录出正义和反义的RNA,两条RNA链通过退火形成dsRNA。当线虫以此大肠杆菌为食时，就摄取了大肠杆菌合成的dsRNA，并触发了线虫体内RNA干扰的发生。本实验将利用表达tag-214dsRNA的大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag-214基因功能的目的。

四、实验材料：

1.秀丽线虫（C.elegans）rrf-3突变体（RNAi敏感型）

由于线虫的RNA的干扰操作简单快速，且重复性好，已成为鉴定基因功能以及基因间互相作用关系的有效材料。

秀丽线虫属于线性动物门，线虫纲，小杆线虫目，广杆线虫属。秀丽线虫是一种生活在土壤中的线虫，长约1mm，直径70um，由959个细胞组成。秀丽线虫具有雌雄同体和雄性个体两种性别。雌雄同体的线虫有两条X染色体和5对常染色体。其基因组大小为80Mb，包含13000个基因。

如上左图为秀丽线虫的模式图（上为雌雄同体，下为雄性个体），右图为秀丽线虫的生活史。

线虫具有生活周期短，易培养和保存等优点，由于其身体透明，因此可以在显微镜下跟踪观察每个细胞的命运，是目前遗传学、发育学和细胞生物学研究的重要模式生物。

2.大肠杆菌野生型菌株OP50

菌株OP50是一种尿嘧啶缺陷型大肠杆菌，它涂布于NGM培养基上，由于该种大肠杆菌是尿嘧啶缺陷型，只能从NGM中获取尿嘧啶，无法自身合成。所以生长速度会比普通的大肠杆菌慢很多，这样既可以提供线虫食物，又不会过度生长。如果用普通的大肠杆菌，由于没有限制，会过度生长，而且湿度，氧气已经各种环境因素会制约线虫的生长。

3.带有tag-214发夹结构质粒的HT115菌株

将构建好的质粒转入大肠杆菌HT115，在IPTG诱导下成功获得目的基因对应的双链RNA。

五、实验试剂：

1.NGM普通固体培养基(1L配方)

NaCl3.0g

细菌蛋白胨16.0g

蒸馏水1.0L

琼脂16.0g

1mol/LMgSO41.0ml

1mol/LCaCl21.0ml

高压灭菌后加入下列溶剂（每组分配以上溶液250ml）

胆固醇250\t/_blankμL

1mol/L磷酸钾缓冲液6.25ml配方(1L)

KH2PO4129.25g

K2HPO451.75g

2.含有氨苄青霉素和IPTG的NGM固体基（用于RNAi）(1L配方)

NaCl3.0g

细菌蛋白胨2.5g

蒸馏水974ml

酵母提取物0.8g

琼脂17.0g

1mol/LMgSO441.0ml

1mol/LCaCl221.0ml

高压灭菌后加入下列溶剂（每组分配以上溶液250ml）

胆固醇250\t/_blankμL

1mol/L磷酸钾缓冲液6.25ml配方(1L)

KH2PO4129.25g

K2HPO451.75g

1mol/L氨苄青霉素1.2ml

IPTG的终浓度达到4mmol/L

3.LB液体培养基(1L配方)

NaCl1%

牛肉膏蛋白胨1%

酵母提取物0.5%

加蒸馏水补足1L

4.M9缓冲液(1L配方)

Na2hpo