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体外gRNA快速合成及检测的方法-分子生

物学论文-生物学论文

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基因定点敲除技术通过对染色体上基因特异位点进行定点突

变，使其功能丧失，进而达到研究其功能的目的。一些利用基因敲除

技术创建的动物疾病模型对医学研究的发展做出了重要贡献。传统基

因敲除技术于上世纪80年代末由Smithies等[1]创立，通过同源重

组手段将构建的外源DNA片段插入并替换相应染色体上特定的区

段，达到基因敲除的目的。这一技术的应用使人类能够有目的地研究

基因功能和与之相关的疾病之间的直接关系。然而由于同源重组技术

需要载体构建、ES细胞打靶、筛选、显微注射、小鼠鉴定等一系列

较为复杂的操作步骤，并且成本较高、周期较长，限制了这一技术

的应用。针对同源重组的缺点，科学家一直在探索用其他更简便的技

术来实现基因敲除。先后发明了ENU随机突变、基因捕获、ES细胞

基因敲除细胞库等方法和手段，但由于技术手段和操作成本的限制，

这些技术都不能完全替代传统的同源重组技术。

2009年以后出现了一系列新的基因编辑技术，包括ZFN、

TALEN和CRISPR/Cas9,开创了基因敲除（敲入）新的时代。这些

新基因编辑技术作用原理相似，即通过核酸酶在目的基因的DNA双

链上制造切口，然后利用生物体自身的修复机制以同源重组或者非同

源末端连接的方式实现修复，进而达到基因失活的目的。作为一种最

新的基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术通过gRNA识别特异的靶序

列，同时介导Cas9核酸酶在DNA的特异位点上制造切口[2],然后利

用生物体自身的修复机制进行DNA修复。这一过程中可能造成碱基

改变、增加、缺失等突变现象，进而实现对目的基因的敲除与修饰[3].

CRISPR/Cas9系统的高效基因组编辑功能已被成功应用于多

种生物。包括人类细胞,斑马鱼[5]、小鼠[6,7]、大鼠[8]、植物[9,10]及

细菌[11].众所周知，生物体的一个性状往往由多个基因共同决定，传

统的基因敲除费时费力却只能一次敲除一个相关基因，而

CRISPR/Cas9系统其中一个最重要的特点便是可在多个不同gRNA

的引导下由Cas9核酸酶一次靶向敲除多个基因组位点[12,13].与其

他基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统具有其独特的优势：首先，

其RNA识别DNA机制即核酸之间的相互识别，避免了DNA甲基

化造成的影响。其次，与ZFN和TALEN相比，具有相同或更高的基

因编辑效率，尤其在点突变方面优于ZFN和TALEN[14,15].

第三，设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶表达载体，

适用于任何分子生物学实验室。

当前基因编辑技术迅速发展，CRISPR/Cas9技术以其优势必将

迅速推动基因组功能的研究。快速获取目标gRNA并检测验证其活

性将会推动这项技术的发展。本文旨在建立一种体外gRNA快速合

成及检测的方法，这一方法的建立将减少利用该系统实现基因编辑的

时间，快速实现目标基因的敲除。

1材料和方法

1.1材料

8周龄SPF级C57小鼠，由华阜康生物科技股份有限公司

提供【SCXK（京）2014-0004】，PCR仪（Bio-RadT100TMThermal

Cycler）、Tanon全自动数码凝胶成像分析系统（上海天能公司）、

NanoDrop2000超微量分光光度计（Thermo）、T7转录试剂盒

（Ambion_mMESSAGE_mMACHINE_T7）、RNA纯化试剂盒

（MEGAclearTMKit,Ambion）、PCR产物纯化试剂盒（QIAquickPCR

PurificationKit）、无核酸酶水、dNTPmixture、高保真酶Taq酶

（Sigma）、Cas9核酸酶（唯尚立德生物科技有限公司）

1.2gRNA靶点选择及其寡核苷酸链合成

利用设计能够结合NKp46外显子E