菌株鉴定流程总结.pdfVIP

学习总结

各位领导好，从5月25号开始，在周老师的实验室已经进行了十多天的培训，让我学

到很多。现将我在实验室学习的情况总结汇报。

一、细菌鉴定流程：

1.表观观察鉴定：

培养24h的菌落观察，如：菌落形态（圆形、椭圆形等）、大小（直径多少）、表面

光滑度（光滑和粗糙）和隆起情况（扁平，隆起，凸起等）、边缘整齐、菌落的透明度、菌

落（菌落颜色及是否产生色素等）及培养基的颜色（培养基是否变色）等菌落的描述。

显微观察，观察单个菌的形态（杆状，圆形，椭圆形，螺旋形等），是否有芽孢，

荚膜的情况。

染色观察，革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色。

2.分子鉴定：

细菌DNA的提取（试剂盒法）

⑴将菌种接在适宜的液体培养基中，进行液体发酵，180rpm/min，24h培养。

⑵将摇瓶发酵的菌液加到1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，倒掉上清液。

⑶向菌体沉淀中加入200ul缓冲液GA，震荡，至菌体悬浮。如果是革兰氏阳性

菌，则向菌体中加入120ul的Tris盐酸缓冲液，再加入80ul溶菌酶，37℃，30min以上。

⑷向离心管中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀。

⑸加入220ul缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心

以去除管盖内壁的水珠。

⑹加入220ul无水乙醇，充分震荡混匀15s，可能会出现絮状沉淀，简短离心以

去除管盖内壁的水珠。

⑺将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个离心柱CB3中（吸附柱放入收集管

中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

⑻向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸

附柱CB3放入收集管中。

⑼向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸

附柱CB3放入收集管中。

⑽重复操作步骤⑼。

⑾将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3

置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

⑿将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50-200ul

洗脱缓冲液TE（或ddhHO），室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离

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心管中，-20℃保存。

PCR扩增和电泳检测

细菌扩增引物（16SRrDNA）为：

27F：5-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3；

1492R：5-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3。

扩增体系：

10xbuffer5μl

dNTP4μl

Mg2+3μl

引物11μl

引物21μl

Taq酶0.4μl

模板2μl

双蒸水33.6μl

总体积50μl

PCR的扩增条件：

Lidtemp：99℃