重组质粒地酶切鉴定和PCR实验.pdfVIP

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重组质粒的酶切鉴定与PCR实验

一、【实验目的】

1、酶切鉴定重组质粒插入片段的大小；

2、学习和掌握PCR反响的根本原理和操作技术，了解引物设计的根本要求。

二、【实验原理】

1、PCR反响根本原理

PCR技术的根本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两

端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个根本反响步骤构成：①模板

DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩

增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作准备；

②模板DNA与引物的退火〔复性〕：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃

左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物

结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反响原料，靶序列为模板，按碱基互

补配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保存复制链，重复

循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保存复制链〞，而且这种新链又

可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的

基因扩增放大几百万倍。

PCR反响原理图

2、PCR反响体系与反响条件

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(1)标准的PCR反响体系

10×扩增缓冲液10μl

4种dNTP混合物200μl

引物10～100μl

模板DNA0.1～2μg

TaqDNA聚合酶2.5μl

Mg2+

加双或三蒸水100μl

PCR反响五要素：参加PCR反响的物质主要有五种即：引物(PCR引物为

DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链〕、酶、dNTP、模板和缓冲液

〔其中需要Mg2+〕。

(2)PCR引物设计

PCR反响中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为

基准〔常以信息链为基准〕，5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA

序列一样；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的根本原如此

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出

现非特异条带。ATGC最好随机分布，防止5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排

列。

③引物内部不应出现互补序列。

④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是防止3′端的互补重叠。

⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个

碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否如此易导致非特异性扩增。

⑥引物3‘端的碱基，特别是最末与倒数第二个碱基，应严格要求配对，最优

选择是G和C。

⑦引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、

荧光物质、地高辛标记，参加其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

(3)模板的制备

PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、

真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血

斑、精斑、毛发等。

标本处理的根本要求是除去杂质，并局部纯化标本中的核酸。多数样品需

要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得

到的粗制