ELISA试剂盒生产流程.pdfVIP

标准化操作规程

ELISA试剂盒的生产

本着进一步提高ELISA（含化学发光）试剂盒生产质量的目的，同时便于本部门更好

的实施精细化管理，特制订以下标准化操作规程。

单就ELISA试剂盒的生产而言，此过程相对比较简单，生产的关键在于做好预实验和

生产完成之后的质检。

预实验（此实验的实质是ELISA实验操作流程）：

1.包被抗体经过特殊处理了的采用间接包被法，即先包被浓度为1.6ug/ml的打底物（方

阵法摸索出的最佳包被浓度）37℃放置2h或者4℃过夜，然后用无关蛋白（一般为1%BSA）

进行非特异性的封闭（37℃1h或4℃过夜），接着加入经过特殊处理了的包被抗体（通过方

阵法摸索出最佳浓度，通常为0.1ug/ml或0.05ug/ml）。没有经过特殊处理的包被抗体采用直

接包被法，采用方阵法确定最佳包被浓度（包被浓度通常为0.5ug/ml4ug/ml之间），封闭

条件同间接包被法。目前ELISA（含化学发光）试剂盒的检测方法一般为双抗体夹心法和

竞争抑制法（直接竞争法和间接竞争法）。

a.双抗体夹心法：

2．包被完成之后，加入与包被抗体相对应的经倍比稀释的标准品（一般我们可以通过

查阅文献得知该指标的检测范围）,每孔100ul,37℃放置2h或者4℃过夜

3．加入与包被抗体配对且浓度不同的生物素化的或者未经生物素化的抗体,每孔

100l，37℃放置1h，确定该检测抗体的最佳检测浓度

3.用0.01MTBS洗涤3次,每孔270l，静置1-2min/次,加入不同浓度的HRP标记的亲

和素或者相对应的HRP标记的第二抗体，每孔100l，37℃放置1h，确定最佳检测浓度

4.用0.01MTBS洗涤5次，每孔270l，静置1-2min/次，加入TMB90l/孔（或化学

发光底物），37℃放置5-30min(化学发光实验为10min)，根据颜色的深浅决定终止（2NH2SO4）

的时间

5.将酶标板置于酶标仪中于450nm处读取OD值，化学发光实验采用化学发光仪读取。

b.竞争抑制法：

2.第一步的打底物包被完成后（间接包被法），加入经特殊处理的抗原（间接竞争法）

或抗体（直接竞争法），每孔100ul,37℃放置2h或者4℃过夜

3.加入与该抗原相对应的不同浓度的生物素化的抗体50ul/孔和经倍比稀释的标准品

50ul/(间接竞争法)，或者加入与该抗体相对应的不同浓度的生物素化的抗原50ul/孔和经倍比

稀释的标准品50ul/孔（直接竞争法），37℃放置1h，确定检测抗体或者检测抗原的最佳检

测浓度

4.用0.01MTBS洗涤3次,每孔270l，静置1-2min/次，加入不同浓度的HRP标记的

亲和素每孔100l，37℃放置45min,确定最佳检测浓度

5.用0.01MTBS洗涤5次，每孔270l，静置1-2min/次，加入TMB90l/孔（或化学

发光底物），37℃放置5-30min(化学发光实验为10min)，根据颜色的深浅决定终止（2NH2SO4）

的时间

6.将酶标板置于酶标仪中于450nm处读取OD值，化学发光实验采用化学发光仪读取

包被：

在经过预实验确定各个步骤的最佳工作浓度之后，就可以开始对酶标板进行包被了，为

了提高工作效率，一般每次以包15张以上为宜，整板之外一般多包6条左右，用于生产完

成后的检测之用，包被完成之后经稳定性处理，将板子置于37℃恒温箱中烘干（1h）,用真

空封口袋封口后做好相应的标记和注明包板时间，与分装好后的检测A，检测B和标准品一

起置于-20℃,其他稀释液等试剂分装好后置于4℃。

质检：

生产完成后，据该试剂盒的使用说明书进行相应的检测，将检测的实验数据记录在册，

作为后续工作的参考之用，最终的检测结果如与预实验结果相符即可发货，否则需要重新质

检，质检仍不合格暂缓发货，经重新调整实验条件再次质检合格后方可用来发货。

ELISA试剂盒成品检测检验过程及注意事项

1.根据实际生产要求生产好的每种指标的板子都是若干个整块板子+剩余的几条散条。整

块的板子用于发货用，而那所剩的几条是用于出货前的产品质量检测的。

（注意事项）：（1）上