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实验一植物培养基的制备与灭菌一、实验目的1、学习和了解培养基母液的配制方法。2、掌握培养基的配制方法。3、学习和了解培养基、器皿和相关设备的灭菌方法。二、主要实验用具和仪器设备烧杯(1000ml、500ml、100ml、50ml)、量筒(2000ml、1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、25ml、10ml)、容量瓶(1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、25ml)、试剂瓶(1000ml、500ml、200ml、100ml、50ml)、玻璃棒、油性标记笔、移液枪(5ml、1ml、200μl、100μl)、对应的枪头、培养基瓶(1000ml、500ml、200ml)等。电子天平(感量为0.1mg、10mg)、pH计、灭菌锅、微波炉、磁力搅拌器、电磁炉、超净工作台等。三、实验药品按培养基配方准备。1NNaOH、1NHCl。四、实验内容(一)MS培养基母液的配制1、大量元素母液的配制(配1L)无机盐中大量元素母液,按照培养基配方的用量,把各种化合物扩大10倍,分别用50ml烧杯称量,用蒸馏水溶解,必要时加热。溶解后,倒入1000ml容量瓶中,最后用蒸馏水定容。在混合定容时,必须最后加入氯化钙,因为氯化钙与磷酸二氢钾能形成难溶于水的沉淀。将配好的混合液倒入细口试剂瓶中,贴好标签。配制培养基时,每配1000ml培养基,取大量元素母液100ml。化合物名称每升培养基用量(mg/L)扩大10倍称量(g/L)备注NH4NO3165016.5每升培养基取母液100mlKNO3190019.0KH2PO41701.7MgSO4●7H2O3703.7CaCl2●2H2O4404.42、微量元素母液的配制(配0.5L)无机盐中微量元素母液,按照培养基配方的用量,把各种化合物扩大100倍,分别用50ml烧杯称量,用蒸馏水溶解,必要时加热。溶解后,倒入500ml容量瓶中,最后用蒸馏水定容。化合物名称每升培养基用量(mg/L)扩大100倍称量(mg/0.5L)备注MnSO4●4H2O22.31115每升培养基取母液10mlZnSO4●7H2O8.6430H3BO36.2310KI0.8341.5Na2MoO4●2H2O0.2512.5CuSO4●5H2O0.0251.25CoCl2●6H2O0.0251.253、铁盐母液的配制(配0.5L)目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物,必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便,又比较稳定,不易发生沉淀。常常配成200倍母液,溶解时可加热。化合物名称每升培养基用量(mg/L)扩大200倍称量(g/0.5L)备注Na2EDTA37.253.725每升培养基取母液5mlFeSO4●7H2O27.852.7854、有机物母液的配制(配0.5L)MS培养基中,有机物为甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫氨素(V-B1)、盐酸吡哆素(V-B6),常常配成1000倍或100倍母液。本实验将有机物配成100倍母液。化合物名称每升培养基用量(mg/L)扩大100倍称量(mg/0.5L)备注Glycine(甘氨酸)2.0100每升培养基取母液10mlThiamine-HCl(VB1)0.420Pyridoxine-HCl(VB6)0.525Nicotinicacid(烟酸)0.525Inositol(肌醇)10050005、植物生长调节剂(激素)母液的配制配制生长素类,如2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸等,应先用少量(1-2ml)的乙醇溶解,然后用蒸馏水定容;配制细胞分裂素时,先用少量的1NHCl或1NNaOH溶解,然后用蒸馏水定容。最终各种激素母液浓度应均为1mg/ml。以上各种母液必须用蒸馏水配制,然后保存在冰箱(4℃)中,一般可保存几个月,当发现沉淀或霉团时,则不能继续使用。(二)MS培养基的配制1、培养基配方MS1:MS基本培养基+2,4-D1.0mg/L+KT0.1mg/L+琼脂8g/L(烟草愈伤组织诱导和培养)MS2:MS基本培养基+NAA0.2mg/L+KT1.0mg/L+琼脂8g/L(烟草苗的微繁殖)MS3:MS基本培养基+2,4-D1.0mg/L(烟草细胞悬浮培养)注:MS基本培养基包括大量元素、微量元素、铁盐、有
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