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实验四、特异片段与载体的连接反应（4学时）1.T4连接酶的作用原理2.连接反应体系及反应条件3.连接反应的策略时间安排介绍理论琼脂糖凝胶检查割胶回收的效果连接实验配制培养基LB麦康凯60mMCaCl2溶液概述DNA连接酶及连接机制DNA连接的概念：在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶，前者是T4噬菌体基因30编码的产物，后者是大肠杆菌基因组中lig基因编码的产物。DNA连接酶及连接机制作用机制：DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。反应过程可分三步：(1)NAD或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的ε─氨基上形成共价的酶-腺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸；(2)将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到DNA的5‘-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸；(3)这个被激活的5-磷酰基端可以和DNA的3-OH端反应合成磷酸二酯键，同时释放出AMP。T4DNA连接酶的适当底物一条链带有缺口的双链DNA分子两个不同片段的双链DNA分子之间RNA-DNA杂合体中，作用于RNA链上的缺口，也可将RNA末端和DNA链连接T4DNA连接酶的活性单位和反应条件比较通用的是韦氏单位，一个韦氏单位是指37℃下20分钟内催化32P从焦磷酸根置换到[γβ32P]ATP所需要的酶量。不同厂家的T4DNA连接酶其活性单位和反应条件各异TaKaRa产品活性定义：在20μl的连接反应体系中，6μg的λDNA–HindIII的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位。每个U相当于0.008韦氏单位。10×BufferTris-HCl(pH7.6)660mMMgCl266mMDTT100mMATP1mM10μl反应体系中加入T4DNA连接酶1μl(350U）温度16℃推荐过夜，通常在4℃过夜连接效果尚佳T4DNA连接酶的活性单位和反应条件不同厂家的T4DNA连接酶其活性单位和反应条件各异NEWENGLANDBiolabs产品活性定义：在20μl的连接反应体系中，0.126μM(300μg/ml)5’末端浓度，16℃下反应30分钟，能将50%经HindIII消化的λDNA片段连接所需要的酶量定义为1个活性单位。每个U相当于0.015韦氏单位。10×BufferTris-HCl(pH7.6)50mMMgCl210mMDTT10mMATP1mMBSA25μg/ml20μl反应体系中加入T4DNA连接酶1μl(400U）温度16℃推荐，连接反应可在室温下进行（20-25℃）。粘性末端连接，10分钟即可。平末端连接2小时。65℃下10分钟即可失活。外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略1、PCR产物和T载体的连接外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略1、PCR产物和T载体的连接因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，能直接和T载体进行TA克隆。α-互补的原理载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没