GB_T33410-2016生化试剂中蛋白酶K活性检测方法.docxVIP

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G66

中华人民共和国国家标准

GB/T33410—2016

生化试剂中蛋白酶K活性检测方法

DeterminationoftheactivityofproteaseKinbiochemicalreagents

2016-12-30发布

2017-07-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布中国国家标准化管理委员会

I

GB/T33410—2016

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。

本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、中国标准化研究院。

本标准主要起草人：林霖、周李华、赖心田、兰全学、马爱进、陈国培、李浙、潘兰芳、杨国武。

1

GB/T33410—2016

生化试剂中蛋白酶K活性检测方法

1范围

本标准规定了生化试剂中蛋白酶K活性检测方法。

本标准适用于分子生物学实验中使用的蛋白酶K活性的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

蛋白酶K活性单位proteaseKactivityunit

在55℃,pH8.0时，1min内水解酪蛋白产生1μgL-酪氨酸为一个酶活性单位。

注：活性单位为U/mg、U/g或U/mL。

4原理

蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，可催化含有较多的丝氨酸位点的α-酪蛋白水解。本方法中采用α-酪蛋白为反应底物，经蛋白酶K催化水解为L-酪氨酸，在275nm处测定吸光度值。再通过测量各个浓度的L-酪氨酸标准溶液在275nm处的吸光度值，并构建标准曲线得出线性回归方程，

以外标法定量。计算蛋白酶K的酶活性。

5仪器设备及器具

5.1恒温水浴锅：控温精度士0.2℃。

5.2pH计：精确至0.01pH。

5.3紫外-可见分光光度计：吸光度值精确至0.001。

5.41cm石英比色皿。

5.5电子天平：感量0.0001g。

6试剂

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6882规定的三级水。

2

GB/T33410—2016

6.10.01mol/E.Tris·HCl缓冲液(pH8.0)

称取12.11gTrisbase(三羟甲基氨甲烷盐酸盐)加入适量去离子水使其溶解，定容到100mL,得

1mol/LTris·HCl缓冲液，用浓盐酸调至pH8.0;再取1mL1mol/LTris·HCl缓冲液加去离子水

定容至100mL,即得0.01mol/LTris·HCl缓冲液。

6.20.4mol/L三氯乙酸溶液

称取三氯乙酸65.40g,用去离子水溶解并定容至1000mL。

6.3HCl溶液

量取8.33mL浓盐酸加人到50mL去离子水中，定容至100mL,得1mol/LHCl。

量取10.00mL1mol/LHCl加去离子水定容至100mL,得0.1mol/LHCl。

6.40.5mol/LNaOH溶液

称取2gNaOH,溶解于50mL去离子水中，定容至100mL。

6.510g/L酪蛋白溶液

称取酪蛋白标准品1.000g,用少量0.5mol/LNaOH溶液(6.4)湿润后，加入0.01mol/LTris·HCl缓冲液(6.1)约80mL,在沸水中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转移至100mL容量瓶中，用适量

0.01mol/LTris·HCl缓冲液(6.1)定容至刻度。置于4℃保存备用。

6.6100μg/mLL-酪氨酸标准储备液

称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,用60mL1mol/LHCl溶液(6.3)溶解后定容至100mL,配成1mg/mLL-酪氨酸标准溶液。再吸取1mg/mLL-酪氨酸溶液10.00mL,用0.1mol/L

盐酸溶液(6.3)定容至100mL,即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备液。注意避