SDSPAGE实验步骤分析和总结.docxVIP

试剂：

5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml1mol/L的Tris-HCl（Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃） 50ml0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与xml0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml）(pH6.8),5ml50%甘油，2ml10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml1%

溴酚蓝，

0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。

凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，

4℃保存，一般可放置1个月。

pH8.9分离胶缓冲液：Tris36.3g，加1mol/LHCl48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。

pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris5.98g，加1mol/LHCl48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。

TEMED（四乙基乙二胺）原液。

10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。

pH8.3Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。

置4℃保存，临用前稀释10倍。

考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml70%的过氯酸，最后补足水到

250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。SDS凝胶的有效分离范围

丙烯酰胺浓度

（%）

15 12.5 10

7.5 5.0

线性分离范围 15-435kDa 15-60kDa

器材

电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。样品制备

18-75kDa

30-120kDa 60-212kDa

将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，离心，取上清点样。

电泳

将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddHO冲洗数次，再用乙醇擦

2

拭，晾干；

将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；

按如下体积配制10％分离胶8.0ml，混匀；

ddHO 3.0ml

2

1.0mol/LTris-HCl

pH=8.8

2.1

ml

30%Acr-Bis

2.8ml

10%SDS

10%AP

80ul

56ul

TEMED 6ul

向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20min后胶即可聚合；

按如下体积配制6％浓缩胶3.0ml，混匀；

ddHO 2.0ml

2

1.0mol/LTris-HClpH=6.8 400ul

30%Acr-Bis 600ul

10%SDS 36ul

10%AP 24ul

TEMED 4ul

将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；

装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20μl;

稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45min～1hr；

卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2hr；加入脱色液，置于80rpm脱色摇床上,每20min更换一次脱色液（10ml冰乙酸；45ml乙醇；45ml蒸馏水）至完全脱净。

SDS胶的干燥

凝胶干燥时遇到的主要问题是凝胶的变形和破裂。将凝胶放在Whatman3MM滤纸上可防止干燥凝胶变形，但凝胶是否破裂取决于凝胶的厚度和干燥器的质量，因此，应尽量使用薄胶并使凝胶干燥器处于良好状态，使其真空压力波动极少。

试剂配制步骤

1.固定液：冰醋酸:甲醇:水（10:20:70）

电泳后的凝胶用5～10倍体积固定液在室温下固定，酸性固定液扩散后可使凝胶中的溴酚蓝变黄。蓝色全部消失后，继续固定5min。为防止凝胶破裂，在进行此步骤之前可将凝胶浸泡于含20%甲醇、30%甘油的溶液中过夜。

将凝胶标记好方向后放在保鲜膜或玻璃纸上面，上面放一张比凝胶四周长出

1～2cm的Whatman3MM滤纸。

另将一张滤纸放在凝胶干燥器上。将Whatman3MM滤纸/凝胶/保鲜膜或玻璃纸，放在凝胶干燥器上的滤纸上面，保鲜膜或玻璃纸在最上面。

放下凝胶干燥器的盖子，抽真空使凝胶四周封闭以干燥凝胶，干燥时间常由厂家提供，一般0.75mm厚凝胶干燥2h，如50～65℃可加快干燥进程。

释放真空。如加热状态下干燥，则先停止加热并自然冷却10min后再释放真空。

二

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于