蛋白质分离技术层析.pptVIP

**KL越小，配体对大分子的亲和力越高，在亲和层析中就越有价值。**1、???载体的排斥效应小孔经凝胶会明显阻止大分子物与配基结合2、???载体的空间障碍载体影响了配基的空间，特别是小分子配基。需加碳氢链“手臂”，长度需适中。**影响吸附的因素缓冲液离子成份强度、pH、温度等都有影响。流速尽可能慢，10ml/cm2.小时上柱样品用平衡层析柱缓冲液溶解，浓度约20mg蛋白/ml.上样体积取决于亲和势，低则上样量减少，一般柱床体积的5％。**?非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、介电常数?物质构象改变?浓缩?洗脱?立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复到天然结构离子洗脱能力强弱：CL-I-ClO4CF3COO-SCN≤CCl3COO-蛋白质变性剂，脲或盐酸胍，洗脱后立即稀释或透析。如吸附通过疏水作用，可用降低极性的缓冲液洗脱（乙二醇）。②?特殊洗脱法当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。断键方法：硫酯键：用pH11.5（或1N）羟胺处理半小时偶氮键：0.1M连二亚硫酸钠的0.2M硼酸缓冲液（pH9）二硫键：用巯基乙醇，半胱氨酸，二硫苏糖醇处理③?专一洗脱方法以酶为例：竞争性效应――ESI不如EI稳定，可用游离配基或抑制物（I）洗