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重庆永川区卫星湖水库水体细菌多样性调查

（第二小组廖敏鹏刘兴魏淑婷）

1.卫星湖水库自然环境情况的介绍

重庆市永川区属于亚热带季风性湿润气候，平均气温18.2°C,最高气温39°C,最低气温2C。年平均降雨量1042.2山山，平均日照1298.5^年平均无霜期317d。卫星湖全长8公里，水面1500亩，最大水深15m，库容999X10403湖湾交错，有自然形成的多个半岛和全岛。湖西北岸为全国农业旅游示范区、省级森林公园黄瓜山和著名的比子沟风景区，湖东南岸为金三维生态花卉园区。在2000年卫星湖永川区政府列为永川市民的饮用水源之一，因此明确卫星湖水库中细菌的多样性就显得尤为重要。

2?材料

2.1实验试剂

提取缓冲液：200mMNaPO4,120mM异硫氤酸胍，2%PVP-k30.

150mM氯化钠，2%SDS,0.5MTris

腐植酸去除剂：100mM十二水硫酸铝铵

DNA结合液：4.5M异硫氤酸胍，0.5M醋酸钾（pH5.2），漠酚红少许

膜洗涤液：50mMTris-cl，0.1mMEDTA，pH8.0 70-80%乙醇

洗脱液：2.5mMTris-HCl（pH8.5）或超纯水（无DNA酶）pH8.0

5XTBE（5倍体积的TBE贮存液）

配1000ml5XTBE：

54g27.5g

54g

27.5g

20ml(pH8.0)

硼酸

0.5mol/lEDTA

凝胶加样缓冲液（6X）

0.25%漠酚蓝

0.25%

蔗糖 40%

琼脂糖

漠化乙锭溶液(EB) 0.5mg/ml

TaqDNA聚合酶，10XPCRbuffer,25mmol/lMgcl^0.225mmol/ldNTP,10umol/l引物，模板DNA分子(0.1-2ug/ul)

DNA结合液：6MNaClO4(pH5.2),0.03MNaAC(pH5.2)漠酚红少许

膜洗涤液：50mMTris-cl,0.1mMEDTA,pH8.0 70-80%乙醇

洗脱液：2.5mMTris-HCl(pH8.5)或超纯水(无DNA酶)pH8.0

尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖

PCR扩增相关试剂

2.2实验器材

5ml离心管，1.5ml离心管，枪头，硅胶膜纯化柱。1.6um、0.22um滤膜，真空抽滤装置。

琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像系统或紫外投射仪，PCR扩增仪，PCR用薄壁管，移液枪及电泳仪，高速台式离心机、微量取液器；1.5,0.5和0.2ul的EP管、水浴锅，电子秤、切下的含有回收片段的琼脂糖凝胶P,变性梯度凝胶电泳仪，凝胶成像及分析系,高速离心机，电泳槽。

实验步骤

3.1基因组总DNA的提取

3.1.1水体样品采集

根据河流湖泊采样规则，实地勘察卫星湖周边的环境设施，在卫星湖周边区域设定了10个采样点(具体采样点的分布见图1，学校一侧5个，对岸5个)，每个水样采集1升，记录采样地环境参数(位置GPS经纬度，温度，周围环境描述)。

水体样品采用1.6um孔径的滤膜真空滤除悬浮物和真核微生物，再利用0.22um孔径的聚碳酸酯膜收集微生物细胞。

取下过滤装置漏斗部分，使用两只灭菌镊子从边缘夹起滤膜，滤膜上面朝内卷成圆筒状。放入5ml离心管中-20°C保存备用。

融篆大土 王家沟黄瓜山镇乌龟石兰篆村/.何冢屋基石灰庙村图一.取样位置图

融篆大土 王家沟

黄瓜山镇

乌龟石

兰篆村

/.何冢屋基

石灰庙村

图一.取样位置图

3.1.2微生物基因组DNA提取

⑴.在5ml样品管中加入1ml提取缓冲液

注意：提取缓冲液使用前必须先预热溶解沉淀并趁热使用。若样品中含有难裂解微生物，可额外56C水浴10min。

【去垢剂可破坏细胞壁，去除非DNA的有机、无机成分】

⑵.把5ml离心管放入涡旋研磨仪适配器中，最大转速涡旋振荡5min。

【涡旋振荡的机械作用力在打碎滤膜表面沉积物释放出截留细胞的同时辅助裂解细胞】

⑶.室温4000g离心2min。

⑷.使用1ml枪头深入到底部吸取上清，并转移600ul上清到一个干净的1.5ml离心管中。

⑸.加入0.4倍体积的乙酸铵，混匀，冰上放置10min。

【移除腐植酸、细胞碎片、蛋白等非DNA的有机、无机成分】

⑹13000g离心1min。避开沉淀转移上清到一个干净的2ml管中。

⑺.加入等体积的DNA结合液，混匀。

【DNA在高盐条件下将选择性地吸附到离心柱硅胶滤膜上】

⑻.加载650.l上清到一个离心柱硅胶滤膜中，13000g离心1min。弃去滤液重复上述步骤直到过滤完所有上清。注意：通常需要加样两次。

⑼.加入650口l膜洗涤液到滤膜中，13000g离心1m