8.基因工程药物蛋白的分离纯化与质量控制.ppt

电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品带孔胶按分子大小分离电泳方向电泳小分子大分子夹在两块玻璃板之间的凝胶电泳缓冲液电泳缓冲液加在槽中的经SDS处理的样品分子量小分子量大电源浓缩效应浓缩胶（大孔胶）浓缩胶缓冲液pH6.7Tris-HCl,电极缓冲液pH8.3Tris-Gly解离度：?Cl>?蛋>?Glymcl?cl>m蛋?蛋>mGly?Gly凝胶中Cl－为快离子，Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。缓冲液样品浓缩胶分离胶SDS过程有浓缩效应和分子筛效应浓缩效应样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶浓缩效应样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶浓缩效应样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液浓缩胶样品分离胶浓缩效应样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液浓缩胶样品分离胶分子筛效应蛋白质样品进入分离胶（小孔胶）后pH增大(pH8.9Tris-HC1)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。缓冲液浓缩胶分离胶分子筛效应分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。缓冲液浓缩胶分离胶电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。相对迁移率水平式电泳装置电泳缓冲液凝胶B.等电聚焦电泳（IFE）利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。每种蛋白质都将迁移至与它的pI相一致的pH处。凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3）加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度加样品，然后继续电泳凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。蛋白的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为蛋白的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的蛋白的获得和应用创造了条件。蛋白在结晶之前，蛋白液必须经过纯化达到一定的纯度。如果蛋白液纯度太低，不能进行结晶。通常蛋白的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。总的趋势是蛋白的纯度越高，越容易进行结晶。要说明的是，不同的蛋白对结晶时的纯度要求不同。有些蛋白在纯度达到50%时就可能结晶，而有些蛋白在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以蛋白的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已。盐析结晶有机溶剂结晶透析平衡结晶等电点结晶包涵体的纯化与变复性

概述大肠杆菌表达体系因其具有低廉性、高效性和稳定性等优点在科研生产中被广泛应用。然而,当外源蛋白质在大肠杆菌中高效表达时常形成不可溶、无生物活性的聚集体(aggregation)又称包涵体(inclusionbody),包涵体必须经过变性、复性才能获得生物学功能,而这种变性/复性是在体外环境中进行,缺乏辅助肽链折叠的酶系和分子,造成重组蛋白质在复性过程中形成大量的很难再溶解的蛋白质聚集体,使以包涵体形式存在的高效表达产物大部分成为“看