琼脂糖跑胶分析和总结.docx

0.3

5--60

0.6

1--20

0.9

0.5--7

1.2

0.4--6

1.5

0.2--3

2.0

0.1--2

试剂及配制：

50×TAE缓冲液:2mol/LTris-乙酸,0.05mol/LEDTA(pH8.0)。配制1000ml50×TAE缓冲液方法：Tris

242g，冰乙酸57.1ml，0.5mol/LEDTA100m，l

后.调pH8.0，高温高压灭菌,4℃保存.

加入600ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1L

1×TAE缓冲液的配制:量取20ml的50×TAE缓冲液,再加入980ml的去离子水.

5×TBE缓冲液（Tris-硼酸）:配制1000ml5×TBE缓冲液方法：Tris54g，27.5g硼酸，20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)。加去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1L后.调pH8.0，高温高压灭菌,4℃保存.

溴化乙啶贮存液:10mg/ml溴化乙啶。配制100ml溴化乙啶贮存液方法：称取1g溴化乙啶,置于100ml烧杯中,加入80ml去离子水后搅拌溶解.将溶液定容至100ml后,转移到棕色瓶中.室温保存.。6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油（或40%蔗糖）。配制10ml6×上样缓冲液方法：溴酚蓝25mg

二甲苯青FF25mg，甘油3ml，用6×TAE缓冲液定溶至10ml,分装成1ml/管.-20℃保存.

琼脂糖凝胶电泳操作步骤：1).制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7g(0.5g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.

胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.

加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用

10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).

电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.

电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20min,再用清水漂洗10min.

观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.

常见问题及注意事项：1.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶.2.琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓.3.电泳时应注意电源线路,预防触电.4.溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套.并在专门的实验室内使用.5.紫外线对人体有损伤作用,开灯时间不宜太长,注意防护.6.DNA带形状模糊:DNA加样过多;电压太高;凝胶中有气泡.7.质粒DNA的存在形式有3种,①共价闭环DNA(cccDNA),常以超螺旋形式存在;②开环DNA(ocDNA),此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂,因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子;③线状DNA,因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带,它们的泳动速度为:cccDNA线状DNAocDNA.添加来自TIANGEN的资料:1,琼脂糖:不同厂家＼不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同,影响DNA的迁移及其荧光背景的强度,应有选择的使用.2,凝胶的制备:凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致,溶化的凝胶应该及时倒入板中,避免倒入之前凝固结块,倒入板中的凝胶应该避免出现气泡,以免影响电泳结果.3,电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和PH,应经常更新电泳缓冲液.4,样品加入量:一般情况下,0.5CM宽的梳子可加0.5微克的DNA量,加样量的多少依据加样