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细菌样品前处理
取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。
(1)收集菌体:①液体培养基中的菌体,可取培养液8000rpm离心3~5min,弃上清,倒入2。5%戊二醛固定液;②固体培养基上的菌体,可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落(注意不要刮下培养基)。将菌液吸入小离心管,离心后换入新鲜戊二醛固定。
(2)固定,脱水按常规方法。2.5%戊二醛,2~4h→磷酸缓冲液清洗3次→1%锇酸4~6h
→缓冲液清洗3次→乙醇梯度脱水,30%,50%,70%,85%,95%各一次,100%乙醇2次,15~
20min/次→乙酸异戊酯置换2次,20min/次(注意:每步均需离心,8000rpm,3~5min,弃上清,倒入下一种试剂,滴管来回吸几下,打散菌块)。
(3)临界点干燥:普通定性滤纸裁成35mm×18mm的纸条,将长边35mm平均分成3份,对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状.将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用
钉书器将另一端钉牢。放入临界点干燥器样品室,进行CO临界点干燥。一般每次可同时处
2
理10~20种不同菌样(注意,需用液态CO2置换2~3次)。
(4)离子溅射金:沿两端书钉剪开滤纸包,将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿,轻摇尽量分散菌体。碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上,另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。离子溅射金后,即可进行扫描电镜观察。
细菌样品特殊制备方法;1,固体培养基中的菌体
用镊子夹一小块盖玻片,轻轻放在旺盛生长的菌体上,粘附一定的细菌.然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁,在棕色瓶内加入适量1%锇酸,盖上含有样品的瓶盖,熏蒸固定2h以上。然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上,喷金,进行扫描电镜观察。
2,液体培养基中的菌体
取一定的培养液,8000rpm离心3~5min,弃上清液,加入2.5%戊二醛固定2h,pH7。2磷酸盐缓冲液清洗,然后加入蒸馏水稀释,充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上,吸附2min,用滤纸吸去多余溶液。然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁,在棕色瓶内加入适量1%锇酸,盖上含有样品的瓶盖,熏蒸固定2h以上。然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上,喷金,进行扫描电镜观察。
0.2M磷酸缓冲液的配制:
磷酸二氢钠(NaHPO。2HO) 2.94克
2 4 2
磷酸氢二钠(NaHPO.12HO) 29克
2 4 2
纯水 500mL
pH调至7。4
2.5%戊二醛固定液的配制:
25%戊二醛 10mL
双蒸馏水 40mL
0.2mol/L磷酸缓冲液 50mL
戊二醛最终浓度 2。5%pH值7。3—7.4
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