液体培养基的制备及杀菌.ppt

4、灭菌的方法①化学灭菌：高锰酸钾、漂白粉、双氧水、环氧乙烷、甲醛、75％酒精等；②物理方法：辐射灭菌：X射线、β射线、紫外线、超声波、微波等干热灭菌法：常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。过滤灭菌：微孔滤膜过滤除菌；大多用于热敏性物料湿热灭菌：121℃，保持20-30min；工厂中蒸汽容易获得，控制操作条件方便，采用蒸汽湿热灭菌是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。第64页,共89页，2024年2月25日，星期天5、湿热灭菌原理蒸汽在冷凝时释放出大量潜能，并且具有强大穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。湿热灭菌的效果，取决与加热温度和受热时间。6、培养基灭菌温度的选择灭菌温度的选择应考虑的因素主要有：a.微生物的热致死温度：应高于该温度，通常以芽孢为准。b.营养成分的破坏灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。高温短时灭菌第65页,共89页，2024年2月25日，星期天培养基的热灭菌动力学在一定温度下，活的微生物杂菌细胞（包括杂菌芽孢），受热死亡过程遵照分子反应速度理论，与一级化学反应中未反应分子的减少速度类似。杂菌是一个复杂的高分子体系，其受热死亡是因蛋白质高分子物质不活泼，结果导致蛋白质变性，这种反应同属于一级反应。1．对数残留公式与理论灭菌时间杂菌在一定温度下，受热死亡遵循一级反应方程的规律。第66页,共89页，2024年2月25日，星期天活菌的减少率与有下列关系： ——活菌个数；——受热时间； ——反应速度常数，（s-1），大小与微生物的种类和加热温度有关。将上式积分： ——灭菌时间， ——灭菌开始时，污染的培养基中杂菌个数，mL； ——经灭菌时间后，残存活菌的个数，mL第67页,共89页，2024年2月25日，星期天得：以上两式是分别以自然对数形式和常用对数形式表示的液体热灭菌的对数残留公式。由上两式可得理论灭菌时间：第68页,共89页，2024年2月25日，星期天理论灭菌时间，是指特定灭菌温度下的灭菌时间，但实际生产中蒸汽加热灭菌的时间则以工厂的经验数据来确定，通常高温灭菌时间为15～30s，然后根据生产的类型再在维持罐内维持8～25。若要求培养基灭菌后绝对无菌，即，从上面公式可以看出，灭菌时间将等于无穷大，这当然是不可能的。根据实际情况，培养基灭菌后，以培养液中还残留一定的活菌数来计算。工程上，通常以，即杂菌污染降低到被处理的每1000罐中，只残留一个活菌。第69页,共89页，2024年2月25日，星期天2．灭菌温度与菌死亡的反应速度常数的关系微生物的热死属于单分子反应，所以灭菌温度与菌死亡的反应速度常数的关系可用一级反应的公式——阿累尼乌斯方程表示：取：式中——菌死亡的速度常数，1/——阿累尼乌斯常数，1/；——气体常数（1.987×4.187·）图2-13菌死 亡速度常数与温度的关系——热力学温度，；——细菌孢子的活化能，4.187;——2.718第70页,共89页，2024年2月25日，星期天温度与菌死亡速度常数的关系，可用图2-13(细菌芽孢）作例子说明。在图中k和1/T之间呈直线关系。得：这就是加热灭菌的时间和温度之间的理论关系。实际上，湿热灭菌的时间和温度还要受培养基的质量、杂菌浓度、杂菌种类、培养基的PH等因素的影响。从上式中也可以看出，灭菌时间和温度与活化能有一定的关系。第71页,共89页，2024年2月25日，星期天图2-13菌死亡速度常数与温度的关系第72页,共89页，2024年2月25日，星期天采用高温短时间对培养基进行灭菌，营养成分并不是不破坏，而是高温短时间可以使杂菌死亡，而营养成分因时间短破坏的较少。从而达到既灭菌彻底又较多的保持了营养成分的目的。从表2-2的实验数据中可以清楚地说明这个问题。第73页,共89页，2024年2月25日，星期天表2-2培养基达到完全灭菌时，灭菌温度和时间对培养基养分破坏的比较（以维生素B1为准）灭菌温度