分子生物学实验.docxVIP

-实验一Xoo总DNA的提取

1.Xoo基因组DNA的提取

用牙签挑取少量Xoo菌株接种至含相应抗生素的NYGB中，28℃摇床培养过夜，用移液枪吸取适量菌液于EP管中，离心收集菌体（或者用牙签在平板上挑取一些新鲜Xcc培养物于EP管中），采用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）提取Xoo总DNA，其操作按照说明书进行。

2．基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

制胶：根据DNA片段长度的大小，可配置不同浓度的琼脂糖凝胶。根据所要配制的浓度称取适量的琼脂糖于三角瓶中，加入相应体积的1×TBE缓冲液，微波炉加热融化，室温冷却至50℃左右，倒进插有塑料梳子的胶模具中（注意避免气泡产生），室温放置待凝胶凝固。

电泳：凝胶充分凝固后，小心拔下梳子，将凝胶放置于电泳槽中，加入合适体积的1×TBE缓冲液，使缓冲液没过胶面。吸取适量体积的DNA分子Marker（图1）和样品与含有核酸染料（本实验使用的是gelred）的6×loadingdye（200μL6×loadingdye+400μLddH2O+1μLgelred）混匀，按照标记的顺序加到凝胶孔中，接通电源，DNA开始从负极向正极方向迁移，一般设置电压为100~150V。待溴酚蓝指示带移到凝胶的2/3处，停止电泳，取出凝胶放置在凝胶成像系统中照相并保存。

图1DNA分子Marker

实验二PCR扩增rsmA基因与纯化

XoorsmA基因序列（213bp）：

ATGTTGATCCTCACTCGCCGGGTAGGCGAAACCTTGATGATCGGCGACTCGGTCACCGTGACCGTTCTCGGCGTCAAGGGCAATCAGGTGCGCATCGGTATCACCGCACCCAAGGATGTCGCTGTGCATCGTGAAGAAATCTATCAGCGCATCCAGCGTGGGGATGAGCCGGTCGCTTCCGGCGCACATCACGGTGACGATTCTTCGAATTGA

2.csrA基因的引物：

rsmA-F：CGCGGATCCATGTTGATCCTCACTCGCCG(BamHⅠ)

rsmA-R：CCGGAATTCTCAATTCGAAGAATCGTCAC(EcoRI?)

以Xoo总DNA作为模板，rsm-F/rsm-R为引物进行PCR扩增rsmA基因(目的片段为213bp):

3.PCR反应体系：

Template

0.5~2μL

rsm-Fprimer(10μM)

0.3μL

rsm-Rprimer(10μM)

0.3μL

dNTP(2.5mMeach)

1.6μL

10×PCRbuffer

2μL

TaqDNApolymerase

0.2μL

ddH2O

补水至20μL

total

20μL

4.PCR反应条件：

Cycles

TemperatureandTime

1

95℃(5min)

30

95℃(30s),50~68℃(30s),72℃(20s~3min)

1

72℃(10min)

5.琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物：

参照实验一操作进行

6.PCR产物的纯化

直接使用DNA纯化试剂盒纯化无非特异性条带、清晰大小正确的PCR产物。如PCR产物中存在非特异性条带，则可根据实验需要进行切胶回收：先用琼脂糖凝胶电泳将PCR产物中的目的条带和非特异性条带分离，将凝胶放置在紫外灯下，用干净的手术刀切下含目的条带的胶块放置于EP管中，尽量把多余的胶块切掉，只留下含目的片段的胶块，再用DNA胶回收纯化试剂盒操作说明书进行纯化。

注意：纯化回收的产物需要再进行琼脂糖凝胶电泳检测纯化回收的效果，以便于下一步操作

实验三质粒的提取及定性定量分析

本实验用的质粒是pUC19质粒:

1.质粒DNA的提取：

用牙签挑取适量菌体接种至相应液体培养基中（E.coil用LB培养基），37℃摇床培养过夜，用移液枪吸取适量菌液于EP管中，离心收集菌体（或者用牙签在平板上挑取一些新鲜E.coil培养物于EP管中）。采用天根生化科技有限公司的质粒提取试剂盒（DP103）或采用BioFlux公司的BioSpinPlasmidDNAExtractionKit（BSC01M1）进行提取，其操作步骤按照说明书进行。

2.质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析：

琼脂糖凝胶电泳参照实验二操作，pUC19质粒大小为2686bp

3.质粒DNA的紫外吸收分析：

用分光光度计检测DNA的A260/A280值，用于判断样品的纯度和浓度。

实验四目的DNA、质粒的酶切和连接

1.DNA的酶切

在EP管加入以下酶切反应体系，以1