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从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案

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土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案

一、综述：

淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用【1】。

常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌【2】、凝结芽孢【3】。由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤和植物体表

某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从7.5—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源【6】。

细菌特性

1.繁殖快速:代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。

2.生命力强:无湿状态可耐低温-60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧繁殖)、耐低氧(厌氧繁殖)。

3.体积大:体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。

四、实验材料和用具

4.1土样采集：采集广大植物园内的有机土壤，和生化楼下花坛的有机土壤

4.2营养琼脂(%)：蛋白胨1牛肉膏0.3氯化钠0.5琼脂1.5～2.0蒸馏水

将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～7.4。加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。

4.3淀粉牛肉膏蛋白胨培养基(%)：可溶性淀粉0.2牛肉0.3蛋白1.0氯化钠0.5琼脂1.5～2.0校正pH至7.2～7.4

4.4发酵培养基(%)：玉米粉2黄豆饼粉1.5CaCl0.02MgSO40.02NaCl0.25K2HPO40.2柠檬酸钠0.2硫酸氨0.075(溶解后加)Na2HPO40.2校正pH值7.0

4.5葡萄糖蛋白胨培养基（V.P试验用）（%）：葡萄糖0.5蛋白胨0.5K2HPO40.2校正pH7.2～7.4

4.6蛋白胨水培养基（吲哚试验用）（%）：蛋白胨1%氯化钠0.5%校正pH7.2～7.4

4.7西蒙氏柠檬酸盐培养基（%）：氯化钠0.5硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02磷酸二氢铵0.1磷酸氢二钾0.1柠檬酸0.5琼脂2溴麝香草酚蓝溶液4酚红试剂校正pH6.8

先将盐类溶解于水中，校正pH，再加入琼脂，加热融化，然后加入指示剂，混匀后分装试管，121℃高温灭菌15min。

4.8配制营养明胶培养基（%）：蛋白胨0.5、牛肉膏0.3、明胶1.2，调pH6.8~7.0

4.9耐盐培养基（%）：

=1\*GB3①蛋白胨1牛肉膏0.3氯化钠2琼脂1.5～2.0蒸馏水

=2\*GB3②蛋白胨1牛肉膏0.3氯化钠10琼脂1.5～2.0蒸馏水

=3\*GB3③蛋白胨1牛肉膏0.3氯化钠20琼脂1.5～2.0蒸馏水

=4\*GB