第三章-动物细胞培养基础.ppt

第三章动物细胞工程的实验室基础第一节实验室基本操作技术动物细胞与胚胎工程的操作对象，对操作器具带来的毒性非常敏感，体外培养中任何与培养物相接触的有害物质都会影响培养物的体外生长和增殖，诸如微生物、细胞碎片以及非营养性化学物质等都可能干扰正常的实验结果。培养工作开始之前，对实验室所使用的培养器具进行彻底清洗、灭菌，清除可能残存的细胞毒性物质。动物细胞与胚胎工程实验室基本操作技术主要包括清洗、消毒灭菌(sterilization)、无菌操作及实验室维持等基本环节。第一节实验室基本操作技术一、清洗与包装(一)物品清洗新的或用后的各种器皿，包括玻璃器皿、塑料器皿、金属器械、除菌滤器等都应严格清洗。清洗和消毒过程第一节实验室基本操作技术一、清洗与包装配制洗液的方法是：①按照上述配方，将需要量的重铬酸钾和蒸馏水加到选用的容器内；②向容器内缓慢、分次加入浓硫酸(工业硫酸即可)，轻轻搅拌溶液，以加快散热及促进重铬酸钾溶解。加入浓硫酸时切勿过急，以免液体骤热，发生危险；③自然冷却。一、清洗与包装(二)清洗后物品的包装洗净烘(晾)干的物品应及时包装，以备消毒灭菌。包装的物品也便于消毒灭菌和贮存，同时可防止消毒灭菌后再受污染。包装常用硫酸纸、牛皮纸、纱布、棉布、锡箔纸、铝盒、饭盒、专用金属消毒筒等。包装的方式根据消毒灭菌的方法而有所不同。培养器皿金属器材辅助器材加样器支架离心管冷冻管二、消毒灭菌(一)消毒灭菌方法目前常用的消毒灭菌方法多采用物理方法(如干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤除菌法、射线杀菌法等)、化学方法（消毒剂）以及抗生素(青霉素、链霉素、庆大霉素等)三大类。二、消毒灭菌(一)消毒灭菌方法1．干热灭菌法是利用恒温干燥箱内120oC～150oC的高热，并保持90～120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的的一种方法。主要适用于不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，且不易被高温损坏的玻璃器皿、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品的灭菌。二、消毒灭菌(一)消毒灭菌方法2．湿热灭菌法压力蒸汽湿热灭菌法是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。适合于布类工作衣、各种器皿、金属器械、胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和某些培养液的灭菌。高压蒸汽灭菌器的蒸汽压力一般调整为1.0～1.1kg/cm2，维持20～30min即可达到灭菌效果。二、消毒灭菌(一)消毒灭菌3．射线灭菌法利用紫外线灯进行照射灭菌的方法。紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。紫外线的作用机制是通过对微生物的核酸及蛋白质等的破坏作用而使其灭活。适合于实验室空气、地面、操作台面灭菌。灭菌时间为30min。用紫外线杀菌时应注意，不能边照射边进行实验操作，因为紫外线不仅对人体皮肤有伤害，而且对培养物及一些试剂等也会产生不良影响。二、消毒灭菌(一)消毒灭菌4．过滤除菌法是将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。过滤除菌法大多用于遇热易发生分解、变性而失效的试剂、酶液、血清、培养液等。目前，常用微孔滤膜金属滤器或塑料滤器正压过滤除菌，或用玻璃细菌滤器、滤球负压过滤除菌。滤膜孔径应在0.22～0.45μm范围内或用更小的细菌滤膜，溶液通过滤膜后，细菌和孢子等因大于滤膜孔径而被阻，并利用滤膜的吸附作用，阻制小于滤膜孔径的细菌透过。天平和真空泵二、消毒灭菌(一)消毒灭菌5．化学消毒剂消毒法用于那些不能利用物理方法进行灭菌的物品、空气、工作面、操作者皮肤、某些实验器皿等。常用的化学消毒剂包括甲醛、高锰酸钾、70%～75%乙醇、过氧乙酸、来苏尔水、0.1%新洁尔灭、环氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%～75%乙醇、0.1%～0.2%氯化汞、10%次氯酸钠、饱和漂白粉等进行实验材料的灭菌；利用甲醛加高锰酸钾[(2ml甲醛+1g高锰酸钾)/m3]或乙二醇(6ml/m3)等加热熏蒸法进行无菌室和培养室的消毒。二、消毒灭菌(一)消毒灭菌6．抗生素法主要用于培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段以及作为微生物污染不严重时的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、链霉素和新霉素等。二、消毒灭菌三、无菌操作树立“无菌”意识并落实到行动中！第二节培养液及其配制进行动物细胞、配子及胚胎的体外培养离不开适应其在体外生