核酸扩增技术.ppt

2）可变数目串联重复和短串联重复（STR）亲子鉴定第95页,共98页，2024年2月25日，星期天第96页,共98页，2024年2月25日，星期天作业1.运用分子检验技术如何确诊被检者是否患病，其检验流程如何？图示之2.PCR引物的设计原则是什么？如何设计引物？第97页,共98页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第98页,共98页，2024年2月25日，星期天**********************EcoRI5’-GAATTC-3’5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’P1P2第63页,共98页，2024年2月25日，星期天5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’5’-NNNNGAATTCNNN-3’5’-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3’EcoRI5’-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3’EcoRI+_+_第64页,共98页，2024年2月25日，星期天RFLP的优缺点RFLP用于检测点突变可以确定点突变的位置第65页,共98页，2024年2月25日，星期天二、等位基因特异性寡核苷酸Allelespecificoligonucleotide,ASO是用寡核苷酸探针和PCR产物进行杂交以检测点突变的方法。被检基因片段经PCR扩增并经电泳分离后转移到膜上，分别与经标记的含有正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。PCR产物仅与完全互补的探针杂交现在位置P185第66页,共98页，2024年2月25日，星期天野生型基因DNA突变型基因DNA野生型基因DNA探针突变型基因DNA探针第67页,共98页，2024年2月25日，星期天野生型基因DNA探针突变型基因DNA探针结论：不存在点突变第68页,共98页，2024年2月25日，星期天野生型基因DNA探针突变型基因DNA探针结论：存在点突变第69页,共98页，2024年2月25日，星期天DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离膜上固定DNA片段在缓冲液中将标记的探针加到膜上DNA片段从琼脂糖凝胶上转印到膜上杂交信号的检测第70页,共98页，2024年2月25日，星期天ASO的优缺点用于检测点突变由于探针的序列是已知的，可以确定点突变的位置缺点是成本相对较高，检测一个点突变即需要一对引物和一对寡核苷酸探针现在位置P185第71页,共98页，2024年2月25日，星期天三、单链构象多态性单链构象多态性（Singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）当DNA分子以单链存在时，能在空间内自发地形成二级结构，这种二级结构的空间构象取决于DNA分子本身的的碱基构成，即使一个碱基的差别也会形成不同的二级结构。SSCP用于检测点突变缺点：不能确定突变的位置现在位置P186第72页,共98页，2024年2月25日，星期天三、单链构象多态性突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DNA。只适合于检测200bp以内的DNA靶基因片段实验的关键是控制各种条件以避免在操作过程中DAN单链分子复性为双链。现在位置P186第73页,共98页，2024年2月25日，星期天四、变性梯度凝胶电泳现在位置P186DNA分子的物理特性之一是当DNA分子被加热至其融点温度时双链被打开。融点温度取决于DNA分子本身的序列，不同序列的DNA分子具有不同的融点温度。第74页,共98页，2024年2月25日，星期天变性梯度凝胶电泳技术正是利用了DNA分子的这一特性。在设计引物时使被扩增目的片段的二端含有不同的Tm值，一端较高，另一端相对较低。将这一PCR产物在由变性剂形成梯度的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，当其泳动至相应位置时，片段于Tm值较低一端的双链被部分解链，如此形成的构象至使该片段的电泳迁移率大大降低。现在位置P186第75页,共98页，2024年2月25日，星期天＋－变性剂浓度由低到高Tm值低Tm值高第76页,共98页，2024年2月25日，星期天变性梯度凝胶电泳的优缺点变性梯度凝胶电泳技术用于检测点突变缺点：不能确定突变的位置现在位置P186第77页,共98页，2024年2月25日，星期天Tm值的大小取决于DNA分子的长度和其序列中的G/C含量双链DNA可以结合荧光染料（