微生物细胞的破碎.ppt

若提取产物在细胞质内，需用机械破碎法；若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法；若提取的产物与细胞膜或壁相结合时，可采用机械法和化学法相结合的方法，以促进产物溶解度的提高或缓和操作条件，但保持产物的释放率不变。选择破碎方法的一般原则第63页,共78页，2024年2月25日，星期天细胞破碎方法的研究方向①多种破碎方法相结合；②与下游过程相结合，必须从后分离过程的整体来考虑破碎操作，即破碎过程要易于细胞碎片的除净；③与上游过程相结合，细胞的培养过程及其环境条件对细胞的结构及破碎难易有很大影响。第64页,共78页，2024年2月25日，星期天3.3破碎率的评价破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：Y(％)＝[(N0-N)/N0]×100N0：原始细胞数量N：经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。第65页,共78页，2024年2月25日，星期天直接计数法直接对适当稀释后的样品进行计数，可以通过平板计数技术或在血球细胞器上用显微镜观察来实现最终染色细胞的计数。第66页,共78页，2024年2月25日，星期天(2)间接计数法间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量(可溶性蛋白、酶等)。破碎率可通过被释放出来化合物的量R与所有细胞的理论最大释放量Rm之比进行计算。间接计数法最常用的细胞内含物是蛋白质，特别是酶活性释放到基质中，是破碎程度很好的指示参数。第67页,共78页，2024年2月25日，星期天3.4包涵体的分离和蛋白质复性很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素-6、人γ-干扰素等）不仅不能分泌到细胞外，而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒——包涵体。第68页,共78页，2024年2月25日，星期天包涵体颗粒直径约0.1～3.0μm，随表达产物而异。较大的包涵体可在相差显微镜下观察到，呈现深色的点，所以包涵体又称光折射体。包涵体主要由蛋白质构成，其中大部分是基因表达产物。这些基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。第69页,共78页，2024年2月25日，星期天一．包涵体的形成分析表明，包涵体内除表达产物外，还含有微量的质粒、rRNA和RNA聚合酶。同时，包涵体内的表达产物具有部分二级结构。第70页,共78页，2024年2月25日，星期天包涵体形成的几种可能性：①少量蛋白产生时是可溶的，其后积聚的量过多，在细胞内超过其溶解度而沉淀；将细胞裂解并用适当溶剂稀释后，这类包涵体可转为溶解状态。第71页,共78页，2024年2月25日，星期天②蛋白合成太快，肽链来不及形成正常的折叠构象，导致分子间疏水基相互作用聚合而不溶；此时即使稀释也不能溶解，生物活性也受影响。第72页,共78页，2024年2月25日，星期天③高表达的蛋白没有形成分子内正常的二硫键连接；由于肽键来不及形成正常的折叠构象而导致错误的二硫键连接，或者是高表达时细胞内氧化还原等条件不同而生成不同的二硫键连接。第73页,共78页，2024年2月25日，星期天④蛋白的溶解需要与其他成分结合或经其他成分诱导形成适当的和可溶性的构象；当产生的蛋白量过多，所需其他成分相对不足，如折叠酶和一系列后修饰酶及分子伴侣等，蛋白质就不能溶解。第74页,共78页，2024年2月25日，星期天二．包涵体的分离和蛋白质的复性结实、稳定的包涵体位于细胞质中，可以通过机械破碎的方法使细胞破碎。包涵体为致密凝聚体，密度较大，低速离心便可与细胞碎片和可溶性产物分离。1.包涵体的分离第75页,共78页，2024年2月25日，星期天包涵体大多是蛋白质在过量表达过程中不正确折叠形成的，而正确构象的形成需要进行变性和复性，即在结构上使伸展的肽键成为特定的三维结构；在功能上使无活性的分子成为具有特定功能的分子。2.蛋白质的复性第76页,共78页，2024年2月25日，星期天包涵体回收后，应先加入变性剂溶解包涵体，使之成为可溶性伸展态，然后除去变性剂使表达产物再折叠，恢复天然构型。第77页,共78页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第78页,共78页，2024年2月25日，星期天三．超声破碎法(Ultrasonication)超声破碎也是应用较多的一种细胞破碎法，通常采用的超声破碎机的工作频率为15~25kHz。第31页,共78页，2024年2月2