多聚酶链式反应扩增片段.ppt

三、PCR的实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次第31页,共45页，2024年2月25日，星期天PCR仪第32页,共45页，2024年2月25日，星期天微量离心管微量移液器第33页,共45页，2024年2月25日，星期天1、准备2、移液（二）实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂第34页,共45页，2024年2月25日，星期天①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。②注意：3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。第35页,共45页，2024年2月25日，星期天将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4、离心5、反应②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。第36页,共45页，2024年2月25日，星期天PCR三步曲预变性保温变性94℃30s延伸72℃1min复性55℃30s94℃5min第37页,共45页，2024年2月25日，星期天循环数变性复性延伸预变性94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min第38页,共45页，2024年2月25日，星期天PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6、注意事项①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；②PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。?分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头第39页,共45页，2024年2月25日，星期天（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关第40页,共45页，2024年2月25日，星期天稀释2μLPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零测定取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值计算DNA含量（?g/ml）＝50×(260nm的读数）×稀释倍数2.过程第41页,共45页，2024年2月25日，星期天第42页,共45页，2024年2月25日，星期天比色杯第43页,共45页，2024年2月25日，星期天五、实验小结PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（）为原料,以（）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。模板互补Taq聚合酶四种脱氧核苷酸引物变性、复性和延伸72℃第44页,共45页，2024年2月25日，星期天*感谢大家观看第45页,共45页，2024年2月25日，星期天关于多聚酶链式反应扩增片段温故知新1:组成DNA分子的基本单位是什么?这些基本单位是如何连接成DNA分子的?DNA分子结构有什么特点？第2页,共45页，2024年2月25日，星期天12345DNA的基本单位－脱氧核苷酸第3页,共45页，2024年2月25日，星期天OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’脱氧核苷酸链结构简图磷酸二酯键第4页,共45页，2024年2月25日，星期天ATGCAGCTDNA分子的平面结构氢键