实验分离以尿素为氮源的微生物.ppt

**尿素在高温下分解，故不能用高温灭菌法，只能采取过滤的方法。**为了保证结果准确，一般选择菌落数在30-300的平板上进行计数。**在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。**原理：细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的尿素分解，产生的氨使培养基变碱，于是酚红由黄变红。随着培养时间的延长，红色区域的面积越来越大。**①选择菌落数在30～300的平板上计数。②需培养计算出三个或三个以上的平板菌落求平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。**原理：细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的尿素分解，产生的氨使培养基变碱，于是酚红由黄变红。随着培养时间的延长，红色区域的面积越来越大。关于实验分离以尿素为氮源的微生物课题背景：尿素是一种重要的农业氮肥。但是尿素不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨气以后，才能被植物利用。而土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。第2页,共30页，2024年2月25日，星期天什么是尿素和脲酶？（NH2）2C=O+H2O脲酶2NH3+CO2尿素：又称脲，是蛋白质降解的产物。脲酶：降解尿素的酶。第3页,共30页，2024年2月25日，星期天如何筛选分解尿素的细菌？原理：培养基中的唯一氮源是尿素，只有能分解尿素的细菌（能合成脲酶）能够在该培养基上正常生长和繁殖。碳源氮源第4页,共30页，2024年2月25日，星期天实验原理利用将尿素作为唯一氮源的选择培养基分离出能利用尿素的细菌，再通过稀释涂布分离法，将该菌分散开来，以形成单菌落。细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使pH升高，碱性增强，使酚红指示剂变红。酸碱指示剂：酸黄碱红第5页,共30页，2024年2月25日，星期天例题：下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是（）A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水D.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水选择培养基：只能以尿素为唯一氮源。第6页,共30页，2024年2月25日，星期天实验设备及用品三角瓶、试管和试管架、培养皿、超净台、移液器、玻璃刮刀、酒精灯。第7页,共30页，2024年2月25日，星期天从土壤中采集微生物土壤采样方法：用小铲子去除5cm表土，取离地面5-15cm处的土样1克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧。从有哺乳动物排泄物的地方取得第8页,共30页，2024年2月25日，星期天稀释涂布分离法玻璃刮刀第9页,共30页，2024年2月25日，星期天Step1：培养基的配制和灭菌全营养LB培养基/25mL尿素培养基/25mL蛋白胨0.25g酵母提取物0.12gNaCl0.25g琼脂糖0.5g水25mL葡萄糖0.025gNaCl0.12gK2HPO40.12g酚红0.25g琼脂糖0.5g水15mL尿素溶液10mL特别注意：尿素溶液用G6玻璃漏斗过滤，使之无菌。第10页,共30页，2024年2月25日，星期天Step2：倒平板②将已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基在酒精灯火焰旁分别倒入培养皿中，在超净台上摇匀，平放至凝固。冷却至60℃第11页,共30页，2024年2月25日，星期天Step3：制备细菌悬液1g土样99mL无菌水10-2稀释液10-3、10-4、10-5稀释液第12页,共30页，2024年2月25日，星期天怎样梯度稀释菌液？高浓度→低浓度，换枪头微量移液器第13页,共30页，2024年2月25日，星期天平行重复第14页,共30页，2024年2月25日，星期天每一个稀释度的菌液：接种到3个培养皿中。第15页,共30页，2024年2月25日，星期天Step4：用涂布分离法分离细菌全营养LB培养基（对照组）尿素培养基（实验组）10-310-410-5需要倒3个LB平板，9个尿素平板重复1重复2重复3重复1重复2重复3重复1重复2重复3第16页,共30页，2024年2月25日，星期天取10-3、10-4和10-5的土壤稀