外源基因的表达.ppt

图7.2原核基因转录的起始第21页,共49页，2024年2月25日，星期天图7.3原核基因终止子序列及其结构第22页,共49页，2024年2月25日，星期天图7.4非融合型表达蛋白载体pKK223-3第23页,共49页，2024年2月25日，星期天图7.5分泌型克隆表达载体pINIII系统第24页,共49页，2024年2月25日，星期天图7.6融合蛋白表达载体pGEX系统第25页,共49页，2024年2月25日，星期天图7.74个天然启动子和两个人造启动子的-35区和-10区的碱基序列第26页,共49页，2024年2月25日，星期天图7.8三个重组质粒的cromRNA二级结构第27页,共49页，2024年2月25日，星期天图7.9改变Lac启动子和克隆基因间距离的一般方法第28页,共49页，2024年2月25日，星期天第二节外源基因在真核细胞中的表达1.酵母表达系统酵母（yeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是最理想的真核生物基因表达系统。（1）酵母表达系统的优点基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便。具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后的加工和修饰系统。可将外源基因表达产物分泌到培养基中。对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒。可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。第29页,共49页，2024年2月25日，星期天（2）酵母基因表达载体酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色体DNA上的自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（LEL）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，它既能够在原核细胞（大肠杆菌）中复制，又能在真核细胞（酵母）中复制。■DNA复制起始区a：大肠杆菌源质粒的复制起始序列：使其能在大肠杆菌中复制。b：酵母菌的天然2μ质粒的复制起始序列或酵母基因组中的自主复制序列，使其能在酵母菌中复制。第30页,共49页，2024年2月25日，星期天■选择标记基因a：营养缺陷型选择标记，宿主菌为相应的营养缺陷型。b：显性选择标记（G418等），可采用各种类型酵母细胞作为宿主细胞。■有丝分裂稳定区来源于酵母染色体着丝粒（centromere）片断，能保证表达载体在酵母细胞分裂时，能平均地分配到子代细胞中去。■表达盒表达盒是酵母表达载体的重要元件，包括启动子、分泌信号肽序列、多克隆位点及终止子序列。启动子：保证转录的起始。分泌信号肽序列：引导目的基因蛋白分泌到细胞外。第31页,共49页，2024年2月25日，星期天多克隆位点：供外源基因插入。终止子：保证转录在适当位置停止。（3）酵母基因表达载体的种类■自主复制型质粒载体该质粒含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记、基因克隆位点等关键元件。酵母基因组DNA复制起始区：能够在酵母细胞中自主复制。基因克隆位点：来源于大肠杆菌源质粒，如pBR322。这类载体的优点在于：在酵母细胞中的转化率高，每个细胞拷贝数可达200个缺点在于：由于缺乏酵母染色体着丝粒片断，在细胞分裂过程中不能均匀的分配到子细胞中去，因而经过多代培养后，子细第32页,共49页，2024年2月25日，星期天胞中质粒载体的拷贝数迅速减少。■整合型质粒载体该质粒载体不含有酵母DNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但该质粒含有整合介导区，可以通过DNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，随染色体一起进行复制。■着丝粒型质粒载体该质粒载体是在自主复制型质粒载体的基础上构建而成的，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件（着丝粒），因而能保证质粒载体在细胞分裂时平均地分配到子细胞中去，同时提高了质粒在宿主细胞中的稳定性。■酵母人工染色体第33页,共49页，2024年2月25日，星期天（4）酵母基因表达系统宿主菌目前，作为外源基因表达的宿主酵母菌主要包括：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克努维酵母和多形汉森酵母。（5）在酵母中高效表达外源基因的策略■提高表达载体在细胞中的拷贝数以多拷贝酵母内源性质粒为基础构建的多拷贝表达载体，是提高表达载体在酵母中拷贝数的一个途径。但以上的多拷贝载体在没有选择压力的情况下，可能难以保持其高拷贝数。将外源基因整合到染色体上可维持外源基因在细胞中的稳定性，然而在多数情况下会因为在细胞中的拷贝数较低而影响其表达。第34页,共49页，2024年2月25日，星期天■提高外源基因的转录水平在构建表达载体时组入强启动子，如：酵母磷酸甘油酯激酶基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶