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Untitled9/18/024:23PM
TRANSIENTGENEEXPRESSIONINARABIDOPSIS
PROTOPLASTS
WenbinWeiKeithLindsey
(LeicesterBiocentre,UniversityofLeicester.)
*WehaveusedthismethodofPEG-mediateddirectgenetransferinto
Arabidopsisleafprotoplastsforanalysingthetransientgeneexpression
ofgusAreportergeneconstructs.Theprotocolworkswellforecotype
C24.Wehavenottriedothers.
1.PLANTMATERIAL
*Useaerialpartsof3-4week-oldseedlingsgerminatedfromsurface-
sterilisedseedandmaintainedasepticallyonhalfstrengthMS10.
2.SOLUTIONS
(i)HALFSTRENGTHMS10
HalfstrengthMurashigeandSkoog(1962)Medium,e.g.,Sigma
10gl-1sucrose
8gl-1Difcoagar
pH5.8,adjustedwith0.1MKOH,autoclave
(ii)ENZYMESOLUTION
(Damm,B.Willmitzer,L.1991.Arabidopsisprotoplasttransformationand
regeneration.In:K.Lindsey(ed.)PlantTissueCultureManual,A7.Kluwer
AcademicPublishers,Dordrecht.pp1-17.)
1%(w/v)CellulaseOnozukaR-10
0.25%(w/v)MacerozymeR-10
8mMCaCl2.2H20
0.5Mmannitol
pH5.5,adjustedwith0.5MKOH,filtersterilise
(iii)W5WASHSOLUTION
154mMNaCl
125mMCaCl2.2H20
5mMKCl
5mMglucose
0.5Mmannitol
pH5.8,adjustwith0.1MKOH,autoclave
(iv)SUCROSE
21%(w/v),autoclaved
(v)MANNITOL/MgSOLUTION
15mMMgCl2
0.1%MES
0.4Mmannitol
pH5.6,adjustwith0.1MKOH,autoclave
(vi)PEGSOLUTION
40%(w/v)polyethyleneglycol(PEG)6000inasolutionof:
0.4Mmannitolplus
0.1MCa(NO3)2.4H20
pH8.0,adjustwith0.1MKOH
*pHtakes2-3htostabilise
(vii)PROTOPLASTCULTUREMEDIUM
MurashigeandSkoog(1962)medium,e.g.,fromSigma)
file://localhost/Users/lreiser/Desktop/comguide%20Folder/chap_2_tissue_culture/10_tra
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