(7.27)--中文版QIAGEN Plasmid Purification H细胞生物学细胞生物学.docVIP

QIAGEN?PlasmidPurificationHandbook

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使用前注意事项：

1．?在提low-copy（低拷贝）增加lysisbuffer（裂解液）体积可以提高碱性裂解的效率以及DNA的产量。

2．?BufferP1在使用前加RNaseAsolution（RNA酶溶液），一瓶BufferP1加入一小瓶RNaseA（用前瞬时离心），终浓度为100ug/ml。

3．?检测BufferP1是否有因低温储存而引起的SDS沉淀。如有必要，将SDS在37℃溶解。

4．?BufferP3在4℃下预冷。

5．?选择性操作：把提供的LyseBluereagent（LyseBlue试剂）加入到BufferP1并在用前混匀。一瓶BufferP1加一小瓶LyseBlue（用前瞬时离心），这样LyseBlue被稀释1000倍。

步骤（蓝色为大提的量，括号里为中提的量。）

1.??????在选择平板上挑选一个单克隆，在相应抗性的LB2—5ml中进行初培养：37℃摇床约300rpm下初培养约8h。??（使用的管子或烧瓶至少是培养体积的4倍。）

2.??????将初培养菌液用选择性LB培养基稀释到1/500到1/1000。High-copyplasmid（高拷贝质粒）：用100-200ul（25-50ul）初培养液接种100ml（25ml）介质。Low-copyplasmid（低拷贝质粒）：用250-500ul（100-200ul）初培养液接种500ml（100ml）。37℃摇床约300rpm下初培养约12-16h。???（使用的烧瓶或容器至少是培养体积的4倍。培养细胞的浓度要达到约3-4×109个/ml，也即是每毫升的细胞干重约3g左右）

3.??????4℃离心机6000×g离心15min收集细菌细胞。

??（如果想在此步骤停止以后再做，把细胞-20℃冻存。）

4．10ml（4ml）BufferP1重悬细菌细胞。

（为了使裂解液充分混合进而能有效溶解，需使用较大的容器。并确保BuferP1里已经加入RNaseA。如果BufferP1里已经加入LyseBluereagent，为确保LyseBlue颗粒完全重悬使用前摇一下Buffer瓶子。为使细菌完全重悬，可以斡旋或者用胶吸管来回上下打散细胞直到没有细胞团留下为止。）

6．?加入10ml（4ml）BufferP2，上下颠倒封盖的管子4-6次彻底混合溶液，室温（15-25℃）下放置5min。???

（不要斡旋，因为斡旋能导致基因组DNA被剪断。裂解液会有粘性。溶解反应不要超过5min。装有BufferP2的瓶子用后要立即盖紧，以免被空气中的CO2酸化。

如果BufferP1里加有LyseBlue，那么在加入BufferP2后细胞悬浮液会呈现蓝色。混匀后悬浮液的颜色会很均一。如果悬浮液仍有无颜色区或者褐色细胞团存在，请继续混合直到颜色均一为止。）

6．加10ml（4ml）预冷的BufferP3，立即上下颠倒4-6次混匀，然后放冰上20min（15min）。

（预冷的BufferP3和冰上放置能促进沉淀。加入BufferP3后有乳白色的物质形成且裂解液粘性度减少。沉淀物中含有基因组DNA、蛋白质、细胞残渣和KDS。为保证potassiumdodecylsulfate（十二烷基磷酸钾）沉淀，裂解液要充分混合。若混合液依旧粘稠，请继续混合彻底中和溶液。

如果使用了LyseBlue试剂悬浮液混匀后蓝色要彻底消失呈现无色。悬浮液均匀无色表明SDS已完全沉淀。）

7．?≧20,000g4℃离心30min。立即转移含有质粒DNA的上清液。

（离心前样品需再次混合。离心要在非玻璃管（如聚丙烯）内进行。离心后上清液应是清晰透明的。）

8．?把上清液≧20,000g4℃离心15min。立即转移含有质粒DNA的上清液。

（进行第二次离心是避免仍有悬浮或颗粒物质存在于QIAGEN-tip。是样品浑浊的悬浮物质能阻止QIAGEN-tip并且会降低或消除重力流。

→（样1）从清晰的裂解上清液里取120ul（240ul）样品保存以备跑分析胶确定生长和裂解状态是否最佳。）

9．?用10ml（4ml）BuferQBT平衡QIAGEN-tip500（QIAGEN-tip100）以使柱子为空重力流。

（因为平衡液中有洗涤剂存在，buffer流将通过降低表面张力自动开始。使得QIAGEN-tip彻底排空。因为当半月液面达到柱子的上个玻璃面时buffer流会停止，所以QIAGEN-tip可以无人看着。）

10．从第8步道到QIAGEN-tip用上清液使它通过重力流进入树脂。

（上清液应该立即转移到QIAGEN-tip上。如果