圆二色谱CD原理.ppt

BufferSystemsforCDAnalysesAcceptable:

1.PotassiumPhosphatewithKF,K2SO4or(NH4)2SO4asthesalt.

2.Hepes,2mM.

3.Ammoniumacetate,10mM.

Avoid:Tris;NaCl;Anythingopticalactive,e.g.Glutamate第64页,共72页，2024年2月25日，星期天TypicalConditionsforproteinCDProteinConcentration:0.2mg/mlCellPathLength:1mmVolume：350mlNeedverylittlesample：0.1mgBufferConcentration:5mMoraslowaspossiblewhilemaintainingproteinstability第65页,共72页，2024年2月25日，星期天一般将其始波长定在吸收带开始前50-100nm，吸收带过后CD为0即可终止扫描。对于未知样品，可先扫描较宽的波长范围以确定之。第66页,共72页，2024年2月25日，星期天举例第67页,共72页，2024年2月25日，星期天25bpRNA片段（15~79℃）第68页,共72页，2024年2月25日，星期天ThermalmeltingcurvesforssDNA(0.8uM)inDEAB(3.3mM)aqueoussolution(a),DEAB(3.3mM)/SDS(6.7mM)mixedsystem(b),SDSaqueoussolution(c)andwater(d).Thesolidlineswereobtainedbyfittingthedatatoasigmoidalfunction.CDspectraforssDNA(2.7uM)in3.3mMDEABaqueoussolution(a),inwater(b),in6.7mMSDSaqueoussolution(c)andinDEAB(3.3mM)/SDS(6.7mM)mixedsystem(d)at150C第69页,共72页，2024年2月25日，星期天0.01cmcell0.1cmcell第70页,共72页，2024年2月25日，星期天胶原蛋白（5~60℃）用0.01cmcell时才出现明显的峰第71页,共72页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第72页,共72页，2024年2月25日，星期天CD能够提供的信息：primarystructure,secondarystructuretertiarystructureAlpha-helix,beta-sheet肽链骨架的构象变化蛋白质的紫外吸收光谱主要有两个峰：190-250nm：肽键280-290nm：酪氨酸tyr，色氨酸trp第32页,共72页，2024年2月25日，星期天10、J-810圆二色光谱仪S1-S2:第一级单色器；S2-S3:第二级单色器;M：球面反光镜；P：晶体石英棱镜；L:透镜；F:滤光器；第33页,共72页，2024年2月25日，星期天由CDM交互形成的左、右旋圆偏光通过光学活性物质，透射光强度随时间的变化当调制电压过其峰值（正和负）时，εR＞εL时，透过的右旋圆偏光的光强对应于最大值，而左旋最小（实线）；εR＜εL时，透过的左旋圆偏光的光强对应于最大值，而右旋最小（虚线）。PMT的输出信号由正比于IA的直流分量和正比于S的交流分量所组成。直流成分IA=（IL+IR）/2交流成分S相当于圆二色性透射光强的变化频率与外加调制电压的频率相同。第34页,共72页，2024年2月25日，星期天圆二色光谱仪工作原理用相同强度，相同频率的左、右旋圆偏光交替照射样品测得透过样品后的强度IR和IL由于IR和IL十分接近，令IA=（IL+IR）/2，S=IR–IL只放大相应于S的PMT输出电压Es（交流信号），而不放大相应IA的输出电压EA。（适当选取放大倍数G值，使ESG与EA可比）。第35页,共72页，2024年2月25日，星期天PeltierCellHolderCD/TotalFluorescenceFMOStoppedFlow-20～200℃