免疫学试验技术.ppt

2.T细胞亚群检测技术T细胞总数：CD3；TH:CD4；Tc:CD8应用针对CD抗原的单抗来鉴别各T细胞亚群。2.1间接免疫荧光法分离淋巴细胞CD单抗荧光二抗镜检计数2.2流式细胞术分离淋巴细胞CD单抗荧光二抗FACS测试管计数第9页,共22页，2024年2月25日，星期天（二）淋巴细胞功能测定淋巴细胞转化试验淋巴细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原（如PHA、ConA）或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，此称为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可以反映机体的细胞免疫水平，因此，可作为测定机体免疫功能的指标之一。淋巴胞转化试验的方法有形态学方法、MTT法、3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法。第10页,共22页，2024年2月25日，星期天A、形态学方法1、原理淋巴细胞在体外培养过程中受有丝分裂原如植物血凝素（PHA）等刺激后，可转化为体积较大的母细胞，胞浆增多而深染，核增大并可见核仁部分细胞可出现有丝分裂，计数转化细胞的百分率可反映机体的细胞免疫功能。第11页,共22页，2024年2月25日，星期天2、方法（1）取无菌肝素抗凝血0.1ml，加入1.8ml细胞培养液中，同时加入PHA（1000μg/ml）0.1ml，对照管不加PHA，将细胞置37℃、5%CO2培养3天，每天摇动1次。（2）培养结束时吸弃大部分上清液，加入4mlNH4Cl（8.5g/L）混匀，置37℃水浴10min。（3）2500r/min离心10min后弃去上清液，沉淀加5ml固定液，室温作用10min。（4）离心（2500r/min，10min）后弃上清液，留0.2ml沉淀细胞制片，迅速吹干。（5）吉姆萨染色10—20min，水洗，干燥。（6）油镜计数200个淋巴细胞中转化的细胞数，计算转化率。第12页,共22页，2024年2月25日，星期天3、结果（1）淋巴母细胞的形态学标准是细胞核的大小，核与胞浆的比例、胞浆染色性及核的构造与核仁的有无。成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为6—8μm，核染色质致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。过渡型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约10—20μm，核染色质致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。淋巴母细胞：细胞体积增大，约20—30μm，形态不整齐，常有小突出，核变大，核染色质疏松，有核仁1—2个，胞浆变多，常出现胞浆空泡。其它细胞：如中性粒细胞在培养72h后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。第13页,共22页，2024年2月25日，星期天（2）淋巴细胞转化率的计算按上述分类检查推片头体尾三部分，计数200个淋巴细胞，算出百分率。转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞。在正常情况下，PHA诱导的淋巴细胞转化率为60%-80%，如为50%-60%则偏低，50%以下则为降低。图淋巴细胞转化示意图第14页,共22页，2024年2月25日，星期天B、MTT法1、原理MTT法即四甲基偶氮唑盐微量反应比色法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯溴化四唑，水溶液为黄橙色。淋巴细胞受到ConA作用红发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臢颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经SDS/盐酸-异丙醇溶解为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，测定波长570nm。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。第15页,共22页，2024年2月25日，星期天2、方法（1）淋巴细胞的分离与培养常用来分离淋巴细胞的分层液（聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液，比重是1.077±0.001）。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml时仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到淋巴细胞。第16页,共22页，2024年2月25日，星期天取抗凝血1ml，加入37℃预温的PH7.40.01MPBS