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摘要:某户外购900头育肥猪,体重约25kg,引进一周后发病。病猪主要表现发烧、气喘,用替米考星、多西环素等药物治疗效果不佳,发病率上升,重者死亡,造成一定损失。针对此类病情,作者进行了流行病学调查、临床观察、实体解剖及实验室诊断,确诊该病例是由猪伪狂犬病和副猪嗜血杆菌病混合感染引起,通过采取综合措施控制了病情。
关键词:猪伪狂犬病;副猪嗜血杆菌病;临床症状;剖检变化;gE抗体;细菌分离培养鉴定
1临床症状
病猪精神不振,食欲降低或废绝,发烧,体温39.5~41℃,咳嗽,气喘,关节肿胀,患处手感发热或有波动感,跛行,有些病例表现叫声嘶哑,眼神呆滞,后驱摇摆,走路不稳。重症病例张口气喘,食欲废绝,衰竭而死,病程7~10d。
2剖检变化
颌下淋巴结肿大硬化,坏死,切面呈红白相间(图1);咽部组织水肿;扁桃体充血呈暗红色,有白色豆粒状或片状坏死灶(图2);气管内有丰富的血性黏稠液体或泡沫;肺脏肿大,充血,表面有白色坏死病灶,灶周暗红,病健部分界明显;肺脏被膜表面覆有黄白色纤维素渗出物;心包积水;胸腔积水;腹腔内有纤维素渗出物附着;肝脏肿大,变硬,上有白色坏死灶(图3);肾脏有少量出血点,体积无变化;脾脏上有多量刺状或点状白色坏死灶;肠系膜淋巴结肿大坏死,呈红白相间的大理石样病变,质地硬化;腹股沟淋巴结水肿,切面呈血色点状坏死灶;髋关节、膝关节内有大量黄白色黏稠液体(图4)。
疑似诊断:结合临床症状、剖检病变综合诊断,该猪群疑似感染猪伪狂犬病和副猪嗜血杆菌病。为进一步确诊,进行了实验室诊断。
3实验室诊断
3.1细菌分离培养鉴定
确保整个实验过程严格执行无菌操作。
1)病料采集:无菌采集该病死猪的气管、肺脏和关节液于灭菌容器内备用。
2)实验材料:胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、麦康凯琼脂、普通营养琼脂、NAD(V因子)、新生牛血清、细菌微量生化反应管、革兰氏染色试剂。
3)实验步骤:用灭菌接种环挑取气管内容物、肺脏深部刮取物、关节液三种病料分别接种在三个加有5%牛血清+0.005%NAD的TSA在平板上,置于37℃恒温培养箱中培养24h,观察结果。
菌落形态:三个平板上均长有光滑、圆形、边缘整齐、灰白色、半透明、中等大小的菌落。
培养特性:用灭菌接种环挑取该分离菌单个典型菌落分别接种在5%牛血清+TSA+0.005%NAD平板、5%牛血清+TSA平板、普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板上,置37℃恒温培养箱中培养24h,观察:该菌只能在TSA+牛血清+NAD(V因子)平板上良好地生长,其余三种平板均无细菌生长,说明此菌为“嗜V因子生长菌”。
革兰氏染色镜检:挑取典型菌落,革兰氏染色后显微镜下观察,该菌呈多形性,丝状、纤细长杆菌、纤细短杆菌、小球杆菌或小球菌为淡红色的革兰氏阴性菌(G-)。
生化试验鉴定:该菌尿素酶试验阳性、接触酶试验阳性,氧化酶试验阴性。能发酵蔗糖、葡萄糖,不发酵山梨醇、甘露醇。
根据以上鉴定结果判定,该菌为副猪嗜血杆菌。
3.2猪伪狂犬野毒感染检测
1)组织病原学检测
①样本制备:无菌采集病死猪的颌下淋巴结、扁桃体、脑、脾脏适量,混合研磨、离心、制备,取上清液备用;②实验操作步骤(略)。用猪伪狂犬病毒(gE基因)实时荧光PCR检测试剂盒(世纪元亨)检测上述组织中猪伪狂犬病毒gE基因。结果判定:被检样品阈值(Ct值)≤30并出现特定扩增曲线的为PRV阳性;③检测结果:该样本Ct值=20.37<30并出现特定扩增曲线,PRV核酸阳性,表明该猪感染伪狂犬野毒。
2)猪伪狂犬病毒gE抗体检测?
①需要抽取样本量(n)的确定。根据公式n={1-(1-α)1/D}×{N-(D-1)/2},计算n=58(其中,N-群体数量=900,P-预期流行率=5%,M-检测方法(ELISA)敏感性=98%,α-置信水平=95%,D=N×P×M);②样本制备:用5mL一次性采血器,猪前腔静脉采血,随机抽取58份血样,3,000r/min,离心5min,制备血清;③实验操作步骤(略)。采用IDEXX猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒。使用前,所有试剂和微量包被反应板一律恢复至室温(18~26℃),并通过轻轻涡旋、旋转或颠倒混匀。整个实验过程严格操作程序,且不同的样本和试剂使用不同的吸头。结果有效性:阴性对照N(OD650)的平均值(0.873)减去阳性对照P(OD650)的平均值(0.162)等于0.711,大于0.300,试验成立。计算S/N值,即样品S(OD650)与阴性对照N(OD650)的平均值之比。结果判定:被检样本S/N值≤0.60的,该样本判为阳性,即被伪狂犬野毒感染;被检样本S/N值>0.60,该样本判为阴性;被检样本0.60<S/N值≤0.70,判为可疑;④检测结果:58份被检血清样本,23份样本猪伪狂犬病毒gE抗体
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