免疫组化(2)理论课.ppt

一、检测PCNA抗原的表达可用免疫组织化学方法如S-P法检测大肠癌组织中的抗原表达以检测人大肠癌组织中PCNA抗原和酸性粘液为例第73页,共82页，2024年2月25日，星期天二、AB染色检测粘液的性质在动物体和人体中的各种腺体及许多器官组织都能制造或分泌粘液物质，由于物质中含酸基的不同,而又分为中性粘液物质(neutralmucosubstance)、酸性粘液物质(acidmucosubstance),和混合性粘液物质(mixedmucosubstance),也可称为中性粘多糖、酸性粘多糖和混合性粘多糖。第74页,共82页，2024年2月25日，星期天酸性粘多糖中含有氨基己糖,并含有各种酸根和部分不含酸根的成分称为酸性粘多糖。此种粘多糖还可分为硫酸化和非硫酸化两类(两型)。第75页,共82页，2024年2月25日，星期天强硫酸化粘多糖主要见于皮肤,动脉和肺、软骨、角膜和肥大细胞;弱硫酸化粘多糖多见于领下腺,结肠、气管和支气管的杯状细胞。非硫酸化粘多糖,多见于眼球、脐带,还有气管、支气管,肠道杯状细胞,唾液腺的粘液细胞。第76页,共82页，2024年2月25日，星期天粘液物质用于一般粘液性疾病;肿瘤方面的胃癌,粘液瘤和粘液肉瘤、软骨粘液样纤维瘤,横纹肌肉瘤,动脉粥样硬化和胶原病及慢性胃炎的肠上皮化生等。在显示粘液物质中,一般选用AB法作为鉴别诊断的重要指标。第77页,共82页，2024年2月25日，星期天染色的基本原理是因为阿尔辛蓝或爱先蓝(alcianblue,AB)分子中带正电荷的盐键能够与酸性粘液物质中带负电荷的酸性基因进行结合。第78页,共82页，2024年2月25日，星期天爱先蓝(AB)是一种水溶性的多价碱性染料,它呈现蓝色主要是由于结构中有铜的存在。当采用3%的乙酸作用溶剂时(pH=2.5)它能与硫酸、羧酸及其盐类的酸性蛋白黏多糖形成盐键,从而将它们染成蓝色。第79页,共82页，2024年2月25日，星期天染色步骤(1)DAB显色后的切片蒸馏水冲洗3min×3次。(2)1％爱先蓝（PH2.5），滴染10min，流水洗，蒸馏水冲洗2min×2次(3)梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。[结果]酸性粘液物质呈蓝色第80页,共82页，2024年2月25日，星期天第81页,共82页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第82页,共82页，2024年2月25日，星期天坏死组织着色第41页,共82页，2024年2月25日，星期天内源性生物素—肾小管第42页,共82页，2024年2月25日，星期天IgG交叉反应常引起非特异性背景着色，因不同种系动物分子结构相似，抗一种动物IgG可与另一种动物IgG交叉反应，如：二抗羊抗鼠或羊抗兔血清可与人组织切片上人IgG结合，呈假阳性，用二抗同种动物正常血清封闭某些非特异性结合位点，（正常血清可提供白蛋白，与组织内非特异蛋白结合，含天然抗体中IgG的FC段与待检标本FC段结合），一般用10%正常血清封闭组织10~15分钟。五、正常血清封闭

第43页,共82页，2024年2月25日，星期天抗体与内源性Ig交叉反应：第44页,共82页，2024年2月25日，星期天六、免疫组化技术掌握共同条件

1免疫组化染色中PH值和离子浓度对最终结果有影响，磷酸缓冲液（PBS）PH值中性及弱碱性条件(PH7.8)及低离子强度0.01-0.02M，有利于免疫复合物形成，而酸性条件及高离子强度有利于分解。通常采用0.01MPH7.2-7.4缓冲液作为反应环境洗涤液。

第45页,共82页，2024年2月25日，星期天2.PBS洗涤技术（1）洗涤的目的①保证离子浓度和PH值。②减少非特异反应（抗体不可靠很纯）（2）方法：洗三次，每次5分钟。第46页,共82页，2024年2月25日，星期天3、抗体最佳孵育温度及时间（一抗孵育）湿盒孵育，以防抗体的蒸发和干片。室温25℃或37℃孵育45~1h或更长时间或转4℃过夜。通过预实验，选择合适稀释度，孵育时间与其成正比。孵育时避免干燥，否则会使抗体活性减低或消失。第47页,共82页，2024年2月25日，星期天胞浆着色一抗过浓或交叉反应：p63（乳腺）第48页,共82页，2024年2月25日，星期天七、正确设计实验对照

第49页,共82页，2024年2月25日，星期天免疫组化染色结果分析的质量取决于正确使用各种对照，进行常规免疫组化鉴别诊