医学细胞生物学 第四章-细胞生物学的研究技术.ppt

*加速电压大于120kV的透射电镜。穿透力强，观察标本的厚度可达10um，已达一个完整细胞厚度。可以得到细胞内部的三维精细结构图象，如细胞骨架的立体网络。高压电镜(highvoltageelectronmicroscope)*超薄切片技术负染色技术（染背景不染样品）冰冻蚀刻复型技术扫描电镜样品制备技术电镜样品的制样技术*冰冻蚀刻复型技术标本置于-196?C液氮中冰冻后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。蚀刻断裂*蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。复膜**根据量子力学原理中的隧道效应而设计。分辨率很高，横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。固态、液态和气态物质均可进行观察。利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。扫描隧道显微镜(scanningtunnelingmicroscope，STM)*相对于扫描隧道显微镜，原子力显微镜不要求所观察样品一定要有导电性，所以适用于任何生物大分子的观察。还可以在空气或各种溶剂体系中直接观察，故其适用范围有明显扩大。不会引起样品表面分子的漂移和损坏，其图象的可重复性大大提高。原子力显微镜*第二节细胞的分离与培养有效获得单一类型的细胞获得较大的细胞群体细胞工程方面的应用*一、细胞的分离利用组织块制备细胞悬液，一般用蛋白水解酶处理。从细胞悬液中分离某种细胞：流式细胞仪（flowcytometer,FCM）亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activatedcellsorting,FACS)**二、细胞的体外培养一定条件下，大多数细胞都可以在体外存活并增殖，而且可以表现出它在体内的一些分化特性。1.细胞体外生长条件：培养基：必须氨基酸、维生素、动物血清、糖、盐支持物：塑料、玻璃，或包被包外基质其它条件：pH值、CO2、温度、湿度，无菌环境等*原代培养：由起始实验材料所进行的细胞培养传代培养：对已有的细胞进行的继续培养细胞系：通过原代培养所长出的细胞培养物有限性细胞系：不能传代或只能传少数几代连续性细胞系：能够连续地传很多代永久性细胞系：能够无限地传代细胞株：由单一类型的细胞所组成的细胞系。一些有关细胞培养的概念*2.体外培养细胞的特性形态特征：上皮形、梭形、多角形、圆形…增殖特性：一般细胞能传十代左右，少数细胞可传40-50代极少数细胞变成永久细胞人为分为IIIIII三个时期（增殖期、平殖期、衰退期）功能特性：可以保留活体组织中的某些功能特性，随着传代代数增多，功能特性逐渐丧失的也越多。**三、细胞融合细胞融合（cellfusion）：两个或两个以上的细胞相互接触并合并而形成一个细胞的现象。人工诱导的方法：生物诱导法、化学诱导法、物理诱导法。异核体（heterokaryon）：两个不同的细胞融合到一起，但其核仍然是分开的。合核体（synkaryon）杂种细胞系（hybridcellline）**第三节细胞组分的分析一、细胞器和大分子的离心分离适合于各种细胞器和大分子的分离。原理：利用各种细胞器或组分的大小和相对密度的差异，在同一离心场内的沉降速度不同。过程：匀浆，离心分离，分析*马达冷冻真空沉降物转子装甲室*匀浆物肝脏上清夜完整细胞完整细胞1000g20min核线粒体溶酶体过氧化物酶体微粒体内质网100000g120min105000g20minDNase静置20min10000g20min核糖体*二、蛋白质的层析分离蛋白质是细胞中重要的组分，种类繁多，生化性质和功能活动复杂。原理：利用分子的大小、极性及亲水性等生化特性将不同类型蛋白质进行分离。分离方法：柱层析（离子交换，疏水分子筛，亲和性）；高压液相层析。*凝胶过滤柱层析*离子交换柱层析*亲合层析*第四章

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