酶的定向进化技术.pptVIP

酶的定向进化技术博士生：余奕珂导师：林炳承研究员杜昱光研究员2005年11月7日主要内容天然酶的应用及局限性酶的定向进化的思想酶的定向进化的策略和方法酶的定向进化技术的展望定向进化的原理定向进化＝随机突变＋选择随机突变的策略易错PCR技术(error-pronePCR)DNA改组(DNAshuflling)：由美国Stemmer于1994年首次提出一项体外重组技术随机引发重组(RPR)1998年,Arnold提出了一种有效的新方法交错延伸技术(StEP)：由Zhao等提出,是一种简化的DNAshuffling技术易错PCR易错PCR（errorpronePCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。连续易错PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。DNA改组和外显子改组体外随机引发重组体外随机引发重组(randompriminginvitrorecombination,RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。交错延伸交错延伸(staggerextensionprocess,StEP)在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。定向进化的筛选策略琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。微孔板悬浮法在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。微球细胞固定法与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。流式细胞计数法细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。通过酶促反应的特征加入底物显色荧光共振能量转移同位素标记底物通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测定向进化与自然进化的异同点定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。两者的不同：定向进化技术展望总之，具有新功能和特性的酶可以通过从大量未知的自然种系中寻找以及对现有的天然酶进行改造，对现有的天然酶进行改造可能更加合适。我们相信，随着基因工程技术、蛋白质工程技术以及高通量筛选技术的迅速发展，定向进化技术将成为获得新酶的一个有效快捷的手段，这将为工业生产提供更多性能优良的酶制剂。参考文献NikolaosE.Labrou.Directedenzymeevolution:Bridgingthegapbetweennaturalenzymesandcommercialapplications.BiomolecularEngineering2005,22:vii–ix.HaiyanTao.Milestonesindirectedenzymeevolution.CurrentOpinioninChemicalBiology2002,6:858–864.LindaG.Otten.Directedevolution:selectingtoday’sbiocatalysts.BiomolecularEngineering2005,22:1–9EdgardoTFarinas.Directedenzymeevolution.CurrentOpinioninBiotechnology2001,12:545–551ValeryA.Detectionofbiologicalthreats.Achallengefordirectedmolecularevolution.JournalofMicrobiologicalMethods2004,58:147–168NicholasJ.Turner.Directedevolutionofenzym