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发酵工艺及设备试验报告
学院:化学化工学院
专业:生物工程班级:1201学号:
学生姓名:
日期2014年11月
试验一摇瓶发酵法制备糖化酶
一试验目的
、
(1把握摇床发酵法制备糖化酶的工艺流程及操作方法
(2了解利用黑曲霉菌菌种发酵时的生长条件及留意事项
(3娴熟把握试验过程中的无菌操作和培育条件的选择
二试验仪器及试剂
、
菌种:黑曲霉
仪器:锥形瓶〔500ml)、移液管、恒温水浴锅、秒表、50mL比色管、牛皮纸、
纱布〔8层〕、pH计。
药品:三水乙酸钠、冰醋酸、硫代硫酸钠、碘、氢氧化钠、硫酸、可溶性淀粉、
玉米粉、豆饼粉、麸皮
三、试验原理
摇瓶发酵是试验室常用的通风发酵方法,通过将装有液体发酵培育基的摇瓶
放在摇床上振荡培育,以满足微生物生长、生殖及产生很多代谢产物对氧的需求。它
是试验室筛选好气性菌种,以及摸索种子培育工艺与发酵工艺的常用方法。
葡萄糖淀粉酶〔EC3.2.1.3〕系统名为淀粉α-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗
称糖化酶,是国内产量最大的酶品种。糖化酶对淀粉分子的作用是从非复原末端
切开α-1,4键,也能切开α-1,3键和α-1,6键,产生葡萄糖。
糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非复原末端开头,分解α-1,4-
葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基,能被次碘酸钠氧化,过量的次
碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算酶活力。
四、试验步骤
1.培育步骤
1.1种子培育基制备及灭菌
将颖土豆去皮切块,称取200~300g土豆块放入500mL烧杯中,参加肯定
量水,在电炉上煮沸至土豆块熟透,用120目纱布过滤,滤渣反复用肯定量水清
洗、过滤2次,合并各次滤液且定容至1000mL即得土豆汁。取肯定体积的土豆
汁,在其中参加5%的蔗糖,溶解摇匀并调pH至5.5,即得种子培育基。将适
量种子培育基倒入锥形瓶〔250ml〕,用纱布塞塞住管口,并用牛皮纸包扎,置灭
菌锅中,于121℃下灭菌30min。待灭菌完毕,冷却取出。
1.2发酵培育基制备及灭菌
取6只500mL摇瓶,分别按装液量100、200、300mL配制培育基〔玉米粉
6%、豆饼粉2%、麸皮1%〕,加水后略微摇动,使原料潮湿,浸入水中。用8层纱
布包扎瓶口,再加牛皮纸包扎。置灭菌锅中,于121℃下灭菌30min。
1.3发酵培育基接种:将已生长好的菌种,在无菌条件下,依据10%的接
量〔8%-12%〕接种到发酵培育基上。
1.4发酵培育基发酵:将摇瓶固定在摇床上,培育温度为31℃,转速为
120r/min,培育时间96h。显微镜观看菌丝形态,用试纸测发酵液pH,测定酶活
力。摇瓶培育时观看各种摇瓶机的构造。
2.糖化酶活力测定
2.1待测酶液的制备:
准确吸取液体酶1.00mL,先用少量的乙酸缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,
将上清液留神倾入容量瓶中。沉渣局部再参加少量缓冲液,最终全部移入容量瓶
中,用缓冲液定容至刻度〔估量酶活力在100~250u/mL范围内〕,摇匀。通过4
层纱布过滤,滤液供测定用。
2.2酶活力测定:
于甲、乙两支50mL比色管中,分别参加可溶性淀粉溶液25mL及缓冲液5mL,
摇匀后,于40℃恒温水浴中预热5min。在甲管〔样品〕中参加待测酶液2mL,
马上摇匀,在此温度下准确反响30min,马上各参加氢氧化钠溶液0.2mL,摇匀,
将两管取出快速冷却,并于乙管〔空白〕中补加待测酶液2mL。吸取上述反响液
与空白液各5mL,分别置于碘量瓶中,准确参加碘溶液10mL,再加氢氧化钠溶液
15mL,摇匀塞紧,于暗处反响15min。取出,加硫酸溶液2mL,马上用硫代硫酸
钠标准液滴定,直至蓝色刚好消逝为其终点。
2.3酶活力计算:
样品酶活力〔u/g或u/mL〕=579.9×(A-B)c×n式中:A与B分别为空白、
样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积,mL;c为硫代硫
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