高等动物基因1哺乳动物表达系统(共86张课件).pptVIP

基因工程

GeneticEngineering;基因治疗;第一节高等动物基因工程的基本概念;D哺乳动物表达系统的基因转移方法;优点：表达的蛋白与天然蛋白在结构、糖基化、磷酸化、寡聚体类型和方式上几乎相同，且能正确组装成多亚基蛋白。如EPO（促红细胞生成素）

缺点：哺乳动物细胞的表达水平低；

获得高表达细胞株所需的时间长；

细胞大规模培养的成本高；

哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高；;哺乳动物细胞表达系统的构成;（1）正常的哺乳类动物细胞具有四大生物学特征:;;(3)常用的高等哺乳动物受体细胞;分析蛋白结构100’smg

Formulation

SV40DNA-质粒DNA杂合载体的构建

猴多瘤病毒DNA（SV40）

血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNA转入受

因此，在可能的条件下，尽量使用基因组DNA。

二氢叶酸还原酶（DHR）

哺乳动物细胞内的基因扩增现象

不能在含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基

以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒

DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。

猴多瘤病毒DNA（SV40）

以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建

盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻

基因重排高病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象;3.BHK-21：1961年从地鼠幼鼠的肾脏分离而来成果：用它表达的重组凝血因子VIII已获准投放市场。

4.C127细胞：来自RIII小鼠乳腺肿瘤细胞，特别适用于带有牛乳头瘤病毒（BPV）载体的转染：用C127细胞生产的重组人生长激素（hGH）已获准投放市场，用于治疗生长激素缺乏症。

5.MDCK细胞：1958年从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得的，是贴壁生长的上皮样细胞：有报道用该细胞结合人巨细胞病毒早早期启动子可高效表达分泌蛋白，表达量占细胞分泌蛋白质总量的15%～20%。;(4)高等哺乳动物受体细胞的遗传标记;二氢叶酸还原酶（DHR）;黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）;高等哺乳动物受体细胞的遗传标记;高等哺乳动物受体细胞的遗传标记;（三）哺乳动物细胞载体系统;（1）病毒类载体;1.人腺病毒DNA;*;??病毒感染细胞过程;人腺病毒DNA;重组腺病毒表达载体构建原理;2)转移载体;3)构建重组腺病毒表达载体;(续);人腺病毒DNA;2.猴多瘤病毒DNA（SV40）;猴多瘤病毒DNA（SV40）;猴多瘤病毒DNA（SV40）;猴多瘤病毒DNA（SV40）;猴多瘤病毒DNA（SV40）;3.人乳多瘤病毒DNA（BKV）;人乳多瘤病毒DNA（BKV）;4.人牛痘病毒DNA;人牛痘病毒DNA;人牛痘病毒DNA;;(1)哺乳动物细胞的物理转化法;哺乳动物细胞的物理转化法;哺乳动物细胞的物理转化法;电转化设备;第43页，共86页。;哺乳动物细胞的物理转化法;脂质体介导的基因转移技术;哺乳动物细胞的物理转化法;(2)哺乳动物细胞的病毒转染法;;(1)提高哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本方法;一、载体改造;基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊;DHFR-MTX高效表达系统;GS-MSX高效表达系统;具体实例：将选择基因通过一段寡聚核苷酸连在目的基因的3′端（如图）。前体mRNA在翻译时,位于目的基因3′端下游的共扩增基因的翻译起始的效率大大降低,导致翻译水平明显低于上游的目的基因.;1）在载体上添加染色体上的某些特定序列;(2)转录水平;在载体上安装病毒或细胞来源的强启;1、选择高效多聚腺苷酸加尾信号(pA)

真核基因的hnRNA的加工过程需要多聚腺苷酸加尾信号(pA)。前者多采用SV40的晚期及早期pA、牛生长激素基因的pA和人工合成的pA.;2.剪接信号的运用;2.提高转录因子的表达水平;SV40的终止子（SV40T)

用于诊断与治疗mg–g

出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的

高等哺乳动物受体细胞的遗传标记

（三）哺乳动物细胞载体系统

安全性能好不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤

第二节哺乳动物表达系统

动物珠蛋白基因的内含子、SV40的内含子

疾病模型用于药物筛选研究

病毒启动子的控制下高效表达。

SV40在裂解宿主细胞前的晚期

这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导

因高效表达的一种手段，如：;1.添加Kozak序列;内部核糖体进入位点（IRES）是从细小RN