第十九章 DNA复制、修复课件.pptVIP

;第十九章DNA复制、修复;第十九章DNA复制、修复;第十九章DNA复制、修复;第十九章DNA复制、修复;;复制的要点:

1半保留复制

2有起始点、终止点和方向

3半不连续复制;当细胞分裂,DNA进行复制时，双螺旋结构解开而成为单链，用于合成新的互补链。子代细胞出现新的DNA双链，其中一股单链是从亲代完整地接受过来的。另一股单链完全重新合成，且按碱基配对原则互补。;如果DNA全保留复制：新合成的子链全部进入子细胞;;;复制方向

复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。;★用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度

a.单向

b.双向等速

c.双向异速;★环状DNA复制起点的genemappingP532;（一）、环式DNA复制

环状单链DNA，Φx174

（二）、D－环式

线粒体、叶绿体DNA

不对称复制，两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。

;;?DNA聚合反应必备的条件：

1.底物dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)

2.聚合酶DNA聚合酶（DNA依赖的DNA聚合酶)DNA--pol

3.模板单链的DNA母链

4.引物寡核苷酸引物（RNA)

5.其他酶和蛋白质因子解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶

;DNA聚合活性（5′→3′）;DNA聚合酶的反应特点：

⑴以4种dNTP为底物

⑵反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合。

⑶反应需有引物3，-羟基存在

⑷链生长方向5，→3，

⑸产物DNA的性质与模板相同

;;（1）E.coli.DNApol.I（Kornberg）

单体酶，催化活性：

5，→3，聚合活性

3，→5，外切活性（校对）

5，→3，外切活性（修复）

用蛋白水解酶将DNApol.Ⅰ部分水解可得：

大片段（Klenow）：5，→3，聚合活性、3，→5，外切活性。

小片段，36Kd，活性：5，→3，外切活性（只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复）。;（2）E.coli.DNAPol.Ⅱ

单体酶，催化活性：

5，→3，聚合(活性很低)

3，→5，外切

可能在DNA的修复中起某中作用。

（3）E.coli.DNApol.Ⅲ

寡聚酶。

DNApol.Ⅲ是合成新链DNA主要的酶??又称复制酶(Replicase)

;DNA聚合酶催化的分子机制

来源于病毒、原核生物和真核生物的聚合酶、反转录酶甚至RNA聚合酶的聚合酶区域都有一个类似手指、手掌和拇指的基本结构，存在相似的折叠结构。;;

通过晶体结构和模型研究发现，

手指区域可与未复制的单链模板相互作用，同时手指区域的一部分也参与结合进入底物dNTP。

拇指亚区可与模板－引物DNA双螺旋相互作用。

聚合酶通过保守的氨基酸残基与引物模板复合物相互作用使引物的3’末端定位在手掌和手指的会合点，并与dNTP相对。;;研究还发现，dNTP的进入伴随着两个Mg2＋离子的作用，由此提出了核苷酸加入（聚合）反应的双金属离子机制（twometal-ionmechanism)。

核苷酸的掺入是受模板指导的，所以DNA聚合酶在每个催化循环中都要改变它的核苷酸底物专一性。;DNA聚合酶的聚合反应的保真机制

dNTP的参入遵循碱基配对原则

DNA聚合酶3，→5，核酸外切酶活性校对机制

切除错配的碱基

核苷酸代谢库调节系统和修复系统

调节dNTPs的水平

切除修复、错配修复系统;DNA聚合酶III有6个结合位点

⑴模板DNA结合位点

⑵引物结合位点

⑶引物3，-OH位点、反应位点

⑷底物dNTP结合位点

⑸5，→3，外切位点

⑹3，→5，外切位点(校正)

;DNA聚合酶III的亚基组成;;;DNA复制过程：;1.解螺旋酶;2.单链DNA结合蛋白（SSB）;3.DNA促旋酶;4.DNA连接酶（ligase）;;DNA的双螺旋解开合成RNA引物的过程。

由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，SSB（单链结合蛋白）结合到单链上使其稳定。

引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC）构成的复合体，负责RNA引物的合成。

引发体沿着模板链3’→5’方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。

引物的合成方向也是5′→3′方向。;;★大