动物细胞融合.ppt

离心方法差速沉降离心法速率区带离心法等密度区带离心法密度梯度区带离心法第21页,共28页，2024年2月25日，星期天差速离心法differentialcentrifugation原理：由低速到高速逐渐沉降将不同大小的颗粒分离。加速低速高速差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差较大（一般为10倍）的颗粒。?第22页,共28页，2024年2月25日，星期天二、细胞核的鉴定本次试验细胞选择的是小白鼠的肝细胞，这是因为肝细胞分裂旺盛。鉴定试剂：甲苯胺蓝细胞来源：第23页,共28页，2024年2月25日，星期天甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种,属于醌亚胺染料类,这类染料一般含有两个发色团,一个是胺基,一个是醌型苯环,来构成色原显色。染料除有发色团外,还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色。助色团能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团,还含有两个助色团,为碱性染料,因此可以和组织细胞的酸性物质结合而使其染色。即可染细胞核使之呈蓝色。另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈易染性紫红色，因此可用于肥大细胞的检测，例如色素性荨麻疹。第24页,共28页，2024年2月25日，星期天实验步骤：1、颈椎脱臼法处死小白鼠。迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤。2、称取湿重约1g的肝组织，量取8ml预冷的匀浆缓冲液（0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液）并加入烧杯中，尽量剪碎肝组织。3、将剪碎的肝组织倒入匀浆器匀浆（匀浆器下段浸入盛有冰块的小烧杯中保持低温），捣毁组织，直至看不到明显的组织块。第25页,共28页，2024年2月25日，星期天4、匀浆彻底后，8层纱布过滤（先用少量匀浆缓冲液润湿纱布），滤液转移至玻璃离心管中。5、平衡离心管，离心10min(2500r/min),将上清移入另一玻璃离心管中。取上清液制一张涂片①,沉淀用残余液体吹打均匀，制另一张涂片②，自然干燥。6、将涂片①、②染色10min，冲去染液晾干后，在显微镜下观察。若还需检测其他细胞器，可重复第5步，弃沉淀，取上清液制涂片进行鉴定。第26页,共28页，2024年2月25日，星期天注意事项：1、注意差速离心的时间和速度；2、注意低温条件下操作；3、匀浆时充分破碎组织时间不宜过长，防止破坏细胞核和细胞器。第27页,共28页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第28页,共28页，2024年2月25日，星期天动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动受精作用两个细胞正在融合第2页,共28页，2024年2月25日，星期天动物细胞融合基本过程：第3页,共28页，2024年2月25日，星期天诱导方法：诱导方式物理法：化学法：生物法：灭活的病毒电刺激聚乙二醇PEG第4页,共28页，2024年2月25日，星期天聚乙二醇PEG具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝集作用；在稀释和除去聚乙二醇的过程中，就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，但是它有一定毒性，对有些细胞(如卵细胞)不适用。聚乙二醇PEG诱导融合第5页,共28页，2024年2月25日，星期天实验原理：利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜，在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。第6页,共28页，2024年2月25日，星期天利用PEG介导细胞融合,其融合效果受以下几种因素的影响：PEG的分子量与浓度:细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高,对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。第7页,共28页，2024年2月25日，星期天2.PEG的pH值:经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3.PEG的处理时间:处理时间越长，融合效果越好,但对细