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啤酒酵母的蔗糖酶的提取、提纯及测定

浙江工业大学药学院

生物化学实验论文

2013年12月

啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文

摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化—QSepharose柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的OD540值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。

关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳；

正文：

文献综述

蔗糖酶(Sucrase,EC3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5.

实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会

1蔗糖酶的提取及初步提纯

1.1实验原理

酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。

VC总=Vc·[VA/(VA-3)]·[VB/(VB-3)]=Vc·[VB总/(VB-3)]=8.27ml

1.4.2分析

提取液A、B、C颜色不断便签是因为杂质不断消除。这次的数据与其他小组无太大差距，这不会影响后续实验。

1.4.3结论

VA总=17.0ml；VB总=218.0ml；VC总=8.27ml。

1.5注意事项

①第一次离心后取液体时要小心；

②水浴时的温度不要超过50℃。同时在保温过程中不断摇动锥形瓶。冰浴时要迅速操作；

③冰浴操作过程中慢慢加入缓冲液并搅拌使固体充分溶解，减少损失；

1.6认识与体会

实验操作无明显错误，操作仍能精确，但需锻炼；离心操作前需平衡，否则会损坏离心机；蔗糖酶在50°C以上失活。

2蔗糖酶的纯化——QSepharose-柱层析法

2.1实验原理

离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以一定pH和离子强度的溶液为流动相，流动相和固定相之间发生可逆的离子交换反应，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时，降低pH值或提高离子强度均可使之洗脱下来，用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Cl-浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。

2.2试剂与器材

2.2.2.1试剂

①0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液；

②1mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液；

③0.5mol/LNaOH；

④QSepharose，长期保存需置于20%乙醇中，4℃保存。

注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。

2.2.2.2器材

①层析柱；

②梯度混合器;

③磁力搅拌器，搅拌子；

④紫外分光光度计；

⑤点滴板；

⑥尿糖试纸、擦镜纸；

⑦止水夹；

⑧烧杯、试管。

2.3操作方法

1．离子交换柱的填充：将层析柱垂直固定，加水，排除气泡，再加少量水，装入离子交换剂，至柱高5cm，交换柱上端保留少许水（不得干柱）。

2．缓冲液盐度梯度发生器的安装：在低浓度一段装入搅拌子。且要形成梯度。

3．柱的平衡：