溶菌酶试验综合型实验(实验报告定稿)精讲.pdfVIP

第章引言

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生化技术重要理论

蛋白质提取分离技术

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方

向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、

化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，

把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶提取，层析和结晶等；二

是将混合物置于单一物相中，通过物理场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电

泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、

高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择

材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。

微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。

对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，

以微生物为材料时有两种情况：（）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（）

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利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物

品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组

织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理

好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

1．蛋白质的分离纯化

1.1蛋白质（包括酶）的提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、

丁醇等有机溶中，因些，可采用不同溶提取分离和纯化蛋白质及酶。

1.1.1水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶，通常用量是

原材料体积的倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性

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质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取

时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般

采用低温（度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制（如二

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异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面着重讨论提取液的值和盐浓度的选择。

pH

(1)pH值

蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的值应选择在偏离等电点两侧的范围

pHpH

内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质

构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取

液。

(2)盐浓度

稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护

蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。

缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

1.1.2有机溶提取法

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一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸

或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理

想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和

酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度

范围内不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的及温度选择范围较广，也适用于动植物及