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野生动物腺病毒高通量快速鉴定技术规程
1范围
本标准确立了野生动物携带或感染的腺病毒的高通量快速鉴定技术的原理、试验步骤。
本标准适用于野生动物腺病毒高通量快速鉴定、野生动物携带或感染的腺病毒评估等研
究。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
GB19489-2008,实验室生物安全通用要求。
3术语和定义
GB19489-2008界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
腺病毒adenovirus,adv
无包膜的双链DNA病毒,直径为70~90nm的颗粒,由252个壳粒呈20面体排列构成。
每个壳粒的直径为7~9nm。壳粒里是线状双链DNA分子,约为30~47kb的碱基序列,两
端各有长约100bp的反向重复序列。
3.2
腺病毒DNA样品advDNAsamples
利用野生动物的组织(如血液、咽拭子、肛拭子等)提取腺病毒基因组DNA。
3.3
纳米孔高通量DNA建库nanoporeDNAlibraryconstruction
将提取或纯化的基因组双链DNA,经修复连接测序接头后磁珠纯化完成文库的构建,从
而实现在齐碳研发的纳米孔基因测序平台进行测序的文库。
3.4
纳米孔高通量测序nanoporesequencing
1
单个核酸分子在电场力驱动和控速蛋白的双重作用下,以连续的单链核酸分子形式穿过
纳米尺寸的蛋白孔道,当不同碱基通过时,会对孔道内的离子电流产生不同程度的阻断,通
过捕捉随时间变化的电流信号实时地识别碱基排列信息,从而实现对核酸分子的测序。通过
纳米孔高通量测序可获得野生动物腺病毒核酸的全基因组信息。
3.5
病毒DNA序列分析sequenceanalysis
通过纳米孔测序仪对病毒DNA进行测序,得到的DNA系列与已知病毒序列数据库比对来
确定病毒的类型。
4符号、代号和缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AdV:腺病毒(adenovirus)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)
5野生动物腺病毒高通量快速鉴定试验步骤
5.1样本选取和保存
腺病毒可感染几乎所有的细胞类型。病毒核酸可从待检野生动物的组织、血液、咽拭子、
粪便等提取,组织、血液、鼻咽拭子、粪便的采集方法参见附录A。病毒样本都宜保存在病
毒核酸保存液中,保存管应存放于超低温冰箱中。整个流程需用到的仪器、耗材、试剂见附
录B。
5.2样本处理及核酸提取
按照商品化的自动核酸提取仪和配套病毒核酸提取试剂盒提取腺病毒基因组DNA。组织
样本宜先使用低温研磨仪进行样本低温研磨、离心后,然后再使用自动核酸提取仪及病毒核
酸提取试剂盒提取DNA。样品DNA提取具体步骤参见附录C。提取的基因组DNA浓度用Qubit
荧光计测定,核酸浓度宜大于等于15ng/ul,核酸总量宜为300ng。DNA完整度较好,260/280
比值范围宜在1.8~2.0;260/230比值范围宜在2.0~2.2。达到上述条件的高质量DNA
宜进行核酸建库反应。否则为风险建库,全基因组信息的获得存在未知性,但是病毒类型可
2
判定。
5.3病毒DNA建库
按照商品化的建库试剂盒制备病毒DNA文库(附录D)。制备完成的病毒DNA文库,用
Qubit荧光计测定其核酸浓度。病毒DNA文库的核酸浓度宜等于或大于2ng/ul,核酸总量
宜不少于25ng。达到上述条件的DNA文库可直接进行病毒DNA测序反应或放于-20℃冰箱保
存。
5.4病毒DNA测序
将制备的高质量样本文库与测序反应缓冲液混合均匀后加入至测序芯片中,施加电压后,
检测通道上的纳米孔捕获样本文库进行测序。
按照商品化的测序试剂盒对制备完成的病毒DNA文库处理混合(附录C)。混合后的样
品立即上测序芯片测定。
5.5病毒种类鉴定及全基因组信息获取
基于自主开发的具有友好交互界面的实时序列鉴定程序,测序核酸上机2~3分钟内,
程序会自动识别测序输出文件夹中的改变,每当一条DNA序列被测序输出后,便会立马使用
通用系列对比程序minimap2与参考数据库进行比对。比对结果中出现腺病毒的参考序列时,
则可以
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