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诱导表达

1、挑取含重组质粒的单菌落至５mlLB〔含抗性〕培养基中37℃过

夜培养。

2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将５０µl菌接种到含５mlLB〔含

抗性〕培养基的5ml试管中,37℃震荡培养至OD600≌0.4－0.8〔最

好0.6，单抗大约需２－２.5hr，双抗大约需３－３.５hr〕。

3、取局部液体作为未诱导的对照组,余下的参加诱导剂至终浓度作为

实验组,两组继续在适宜温度下震荡培养４hr。

4、分别取菌体0.5ml,离心10000g×1min收获沉淀，用４０µl蛋

白loadingbuffer重悬，混匀，煮沸５min。

5、离心10000g×5min，取上清作为样品,可做SDS等分析。

蛋白质纯化

亲和层析

一、样品准备

1)准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，

在细胞OD600=0.4-0.8时，用IPTG诱导1-4小时，可以获得理想的表

达效率。收集细胞，置于-20℃或立即进展步骤2操作。

2)用BindingBuffer重悬清洗细胞，混匀，离心收集菌体。再参加1/20

细胞生长体积的BindingBuffer，将菌体悬浮起来，混匀，冰上超声

破碎细胞。

3)10000g，4℃离心20－30min。取上清，置于冰上备用或-20度保

存。

二、层析

1)将处理好的NTA树脂装入适宜的层析柱，将样品加到NTA层析柱

中，流速控制在0.5-1ml/min左右，收集流出局部，用于SDS/PAGE

分析蛋白质的结合情况。

3)用大约5倍柱体积的BindingBuffer洗，流速控制在0.5-1ml/min左

右，直到紫外监测数值根本无变化

4)分别用2－5倍柱体积的梯度ElutionBuffer洗脱，咪唑浓度分别为

40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，500mM。流速控制

在0.5-1ml/min左右，收集洗脱液。待清楚纯化条件后，就可只使用

2个咪唑梯度纯化。

5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是

SDS/PAGE分析。

6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的

目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。

三、柱材料处理

1〕用大约10倍柱体积的StripBuffer洗，流速1ml／min。

2〕用大约10倍柱体积的ddWater洗，流速1ml／min。

3〕用大约10倍柱体积的ChargeBuffer上镍，流速1ml／min。

4〕用大约5倍柱体积的ddWater洗，流速1ml／min。

5〕用大约10倍柱体积的BindingBuffer平衡，流速1ml／min。

四、：溶液配方

BindingBuffer

20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,5mM咪唑

ElutionBuffer

20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,1M咪唑

ChargeBuffer

50mMNiSO〔Nicl〕

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StripBuffer

20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,100mMEDTA

离子交换层析法

离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用

它与流动相中的离子能进展可逆的交换性质来别离离子型化合物的

一种方法。

⒈离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少

量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产

品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使

之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱〞处

理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-

碱-酸〞处理，使最终转为H+型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须

平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要除气泡。

为了防止颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，

同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再

用起始缓冲液淋洗，直至到达充分平衡方可使用。

⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有一样的pH

和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被