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细胞培养

目录

TOC\o1-3\h\z\u实验所需器材 3

超净工作台 3

超净实验室 3

细胞培养箱 3

冰箱 3

细胞储存设备 3

液体除菌过滤装置 3

高温高压消毒装置 3

离心机 4

血细胞计数板 5

2.0其他 5

细胞培养试剂器材处理 5

培养液 5

血清 5

培养用品清洗 5

玻璃器皿的清洗 5

橡胶制品清洗 6

塑料制品的清洗 6

包装 6

灭菌 6

细胞房的日常维护 6

细胞培养所需液体的配制 7

培养液 7

胰蛋白酶溶液 7

血清 7

PBS与MTT 7

冻存液 7

洗液 7

新洁尔灭配制 8

消毒液配制 8

细胞培养基本操作 8

无菌操作 8

原代培养 8

传代培养 8

传代前准备 8

胰蛋白酶消化 9

吹打分散细胞 9

分装稀释细胞 9

继续培养 9

MTT法筛选药物活性 9

种板 9

细胞计数方法 9

初始浓度化合物的配制 10

4.4.4加药 10

加MTT 10

加DMSO 10

细胞冻存 10

细胞复苏 11

实验所需器材

超净工作台

这是一般实验室可采用的普及型无菌操作装置，其工作原理是利用鼓风机驱动空气经过高效过滤装置净化后在通过工作台面，在工作台面构成无菌环境，超净工作台应放在清洁无尘的房间，普通超净台可作生物安全I一级安全柜使用。

超净实验室

空气洁净度应达到104颗粒/m3以下，并且应具有紫外杀菌装置，无菌操作间的房顶、墙壁、地面均应光滑、无死角、并定期进行清洁、消毒、检测。

细胞培养箱

一般情况下使用CO培养箱，这种培养箱不但恒温，还可以控制CO浓度（一般用5%），

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可以稳定培养液的 pH，温度设置为37℃，且温度变化一般不超过 0.5℃，体积通常在

150-200L，相对湿度为100%，95%空气。CO培养箱是实验室必备的仪器，但因其中需放置

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盛水容器而湿度较高，从而导致霉斑（经培养鉴定为丝状真菌）快速生长而影响工作，有碍

观瞻和可能导致试验样本污染或院内感染扩散,所以要定期对培养箱进行消毒，气套式的培养箱用75％酒精直接擦培养箱内壁即可。

冰箱

细胞培养所用的各种液体均应低温保存，4℃冰箱用于存放培养、平衡盐溶液、消化液等即用液体，-20℃冰箱用来储存血清、胰蛋白酶、细胞培养所需添加的蛋白质性的生长因子等，因为这些液体需要冷冻以保持其生物活性,使用时可以放入4℃，避免反复冻融。

细胞储存设备

成功培养的细胞在不用或保存时可储藏在液氮储存罐中，由于液氮会不断挥发，所以需要定期添加液氮，否则待液氮全部挥发，会导致细胞全部死亡，存放液氮储存罐的房间应注意通风，以防止液氮挥发造成操作人员的缺氧。

液体除菌过滤装置

不能用高温高压灭菌的液体可以用微孔滤膜过滤除菌，实验室可选用1l或2L的不锈钢滤器，用橡胶气囊加压过滤，也可以用一次性针式滤器。

高温高压消毒装置

细胞培养及其相关操作所用物品均需做无菌处理。本实验室使用的为自备蒸汽式的消毒锅。

使用步骤：

准备：首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。一般来说每次灭菌前都应该加水。加水不能太少，否则会引起烧干或者爆裂。加水最好加去离子水或蒸馏水，这样产生的水垢少些，而且锅体不容易被腐蚀。

放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。将准备灭菌的培养基及空玻璃器皿用牛皮纸包好，装入锅内套层中，物品放置不宜过多，过挤，锅内应留出三分之一空间。以免防碍蒸汽流通

而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。然后盖严锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间（在温度或者压力达到所需时，一般为121℃，20min,0.1MPa）需要切断电源），停止加热。当温度下降时，再开启电源开始加热，使温度维持在恒定的范围之内。因为温度太低达不到灭菌效果，太高可能会出危险。

灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，10分钟后取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的液体由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

注意事项：

灭菌物品不能堆得太满、太紧，以