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新一代靶向代谢组学测试血浆样品代谢产物提取方法李克峰博士

实验背景和目的

代谢(Metabolism)是维持生物体功能进行的各类生化反应的总称。代谢产物(Metabolites)是参与生物体内代谢的小分子化合物，其分子量一般在 1200Da以下。代谢产物具有非常重要的功能，是基因、蛋白与环境作用的直接反应。新一代靶向代谢组学技术(Next-generationTargetedMetabolomics)是近几年随着检测仪器的更新，刚刚发展起来的代谢组学新技术，旨在测定生物体内所有小分子的代谢产物的绝对浓度，了解其在疾病(Diseases)、胁迫(Stresses)等条件下的变化，进而揭示表观现象后的分子机制。

血浆是生物体内流通的液体，含有丰富各种营养和代谢产物，血浆中的代谢产物大概有至少1000种（脂类仅双键不同，算一种）。由于取血不破坏试验动物，比取动物组织方便，快捷，操作简单，因此成为代谢组学测试的主要样品类型，特别是临床类样品。血浆样品代谢物测试也是临床诊断的重要手段，目前大部分的临床生化诊断都是通过血浆样品进行的。

实验需要准备的材料和器材

提取液(甲醇-乙腈(50:50,V/V)和13C稳定同位素内标物，提前放置-20oC冰箱预冷)；

碎冰或者冰盒

涡旋仪

低温高速离心机（提前置于4oC预冷）

低速临床离心机

肝素钠血浆收集管

SpeedVac/lyophilize或者氮吹干，或者在通风厨挥干

移液枪、枪头、离心管、Marker笔、手套等

医学伦理委员会批准的动物和人操作方法

新一代靶向代谢组学测试血浆代谢产物的提取方法

取全血，置于肝素钠血浆收集管中。

小鼠和大鼠取血部位可以是隐静脉、尾部静脉，取血量至少0.2-0.5毫升。

做好消毒和防护工作，防止感染。

动物实验，每组至少8-10个平行，人的实验至少20个平行，以得到准确的结果。

将肝素钠血浆收集管置于低速临床离心机中，低速离心(800g)10分钟。

此步骤是将血浆(Plasma)与血液中的红细胞(Redcells)分离。

离心速度不能超过1500g，以防止细胞裂解。

转移离心后的上层，即为血浆，将血浆用移液枪转移到新的离心管中，低温冷冻保存。

血浆在上层，红细胞等比重大，在下层。

此处可停止。下面的步骤需要大概40分钟时间，如果时间不够，可将上层血浆冷冻保存，供以后代谢产物提取用。

红细胞等为生物有害物质，且可能含有各种感染人的病毒，因此需要置于特殊

的容器中保存，不能随便丢到普通垃圾中。

取100微升制备的血浆，转移到1.5毫升离心管中。

加入400微升提前预冷的提取液(样品和提取液的体积比为1:4，预先加入13C

代谢产物同位素内标物)，涡旋混匀。

如果血浆不够，或者为节约试剂，也可按照比例缩减，如：50微升样品加200

微升提取液提取液。

平行一次操作，可制备24个样品（根据离心机的转子孔数），其他样品最好是放到冰上，如果确实需要很长时间(2h)，可将剩余样品冻存。

在冰上静置10分钟，使提取液和血浆充分反应，

这一步主要目的是裂解细胞。沉淀蛋白、DNA等大分子物质。

高速离心(16000g,4oC)，10分钟，管上清液为小分子代谢产物。

管底沉淀为DNA和蛋白等大分子物质。

离心速度至少要在10000g以上。

取上清液，到新的离心管中，吹干即可。

取样时，小心不要取到底部的沉淀。另外，不用取出所有的上清液，如果是总体积为500微升，取200微升到新管吹干即可，剩余的上清液，可转移到另一个离心管中，保存在-80oC冰箱，作为备份。

代谢产物在甲醇沉淀蛋白，去除酶以后，特别是吹干后，绝大部分是非常稳定

的。可在室温下放置大约1个月的时间，没有显著的变化，这样方便运输。在移交之前可暂时放在-80oC冰箱。

做好编号，移交样品时，将样品编号分组信息（电子版也可以），一并转移，确保编号能够准确的被其他工作人员识别。