高效液相色谱法.pptVIP

第二部分硬件基础知识HPLC简易流程图储液瓶由机械性能和化学稳定性好的不锈钢、玻璃或聚四氟乙烯材料制成使用过程中储液瓶应适当密闭所有溶剂应先过滤，再装入储液瓶滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于DMF，THF，CHCl3等溶剂脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动常用脱气方法超声脱气减压脱气在线脱气采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配进样器手动进样器自动进样器要求：无残留扩散小进样体积可变可承受高压自动进样器自动进样器清洗（Rinse）：进样针移动到清洗口，针的外壁被清洗液清洗的过程排气（Purge）：排除管路中的气泡和更换旧流动相的过程常用色谱柱反相C18(ODS)、C8、C4、苯基、TMS、氰基正相硅胶、氰基、氨基、二醇基分离模式的选择分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性液相色谱检测器的选择样品的性质分离目的不同，对检测的要求不同定量：高选择性、高灵敏度定性或制备：通用性常用检测器紫外可见光检测器(UV)二极管阵列检测器(PDA)荧光检测器(RF)示差折光检测器(RID)电导检测器(CDD)蒸发光散射检测器(ELSD)质谱检测器(LCMS)原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：朗伯-比耳定律，A＝eCL优点：1）灵敏度高2）对温度和流速不敏感3）可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质启动仪器或开灯后，需要一定的时间使基线稳定检查流通池与管路有无漏液检测时，请关闭前面板清洗流通池，防止堵塞标准流通池：12μL，耐压12MPa（半微量流通池：2.5μL）氘灯：2000小时，不要频繁的开关（3小时）EinEoutA=eCl=-log(Eout/Ein)lC:浓度朗伯-比耳定律(A:吸光度)样品池紫外可见光检测器紫外光区（200~400nm）,氘灯。样品池参比池光电二极管EinEinEin光栅D2/W光源lEout紫外可见光检测器光电二极管紫外可见光检测器紫外检测器紫外检测器**输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器储液瓶数据处理系统脱气机溶剂前处理-过滤过滤：0.45μm或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液溶剂前处理-脱气*输液泵性能要求能在高压下连续工作输出流量范围宽(0.01ml-10ml)输出流量稳定、精确度、重复性高洗脱系统组成等度洗脱系统梯度洗脱系统｛梯度时间B%等度时间B%高压梯度洗脱系统低压梯度洗脱系统分析时间长分离度差MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODS)使用梯度洗脱的原因当采用等度洗脱时：95%30%甲醇浓度在最短时间内获得最佳的分离使用梯度洗脱的原因当采用梯度洗脱时：输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂等度洗脱高压梯度系统数据处理系统泵泵泵ABC进样器分析柱柱温箱检测器混合器梯度准确率高需要2-3个泵可以不配在线脱气机低压梯度系统一台泵最多可使用4种流动相泵前预混合需带在线脱气机低压梯度比例阀数据处理系统ABDC输液泵进样器分析柱柱温箱检测器脱气机混合器流动相的选择水的等级水的等级纯化水蒸馏水（有机物）去离子水(无机离子)因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物波长(nm)纯化水去离子水吸光率HPLC用水可以通过以下几个方法得到：专门的纯水机或超纯水机:理想的HPLC用水应为18.2M?的超纯水，并通过0.22μm的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。去离子