浅析细菌内毒素检测方法及常见问题PPT课件.pptxVIP

浅析细菌内毒素检测方法及常见问题.内容细菌内毒素简介细菌内毒素检测方法常见问题及解决方案.一、细菌内毒素简介主要内容——来源——特性——与热源的关系——在药检中应用.主要来源主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖，这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约在1~5纳米。细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为1至100EU/ml。.主要特性（实验器材处理方法）1.耐热性一般在100℃加热1小时无影响，120℃加热4小时能破坏98％，180－200℃干热2小时或250℃干热半小时才能完全破坏。故：注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。2.不耐酸碱性内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡.主要特性（实验器材处理方法）3.水溶性与不挥发性热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。故：不可用湿热灭菌法处理实验器具.主要特性（去除内毒素方法）4.滤过性原体积很小，约在1～5nm之间，故能通过除菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不能通过半透膜。5.吸附性能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。.热原=内毒素？热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。.热原检查方法简介《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进行检查。将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。.热原检查法.与热源对比内毒素检查法优势方便、快捷、经济；重现性好、灵敏度高；避免抗原的产生，克服生物测定的误差；近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源法.在药检中的应用细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，已经广泛的被世界各国药典收载。成品检查——药品安全性检查之一半成品（生产过程）检查——事前质控手段，避免造成药品成批报废.二、细菌内毒素检测方法《中国药典》批准使用方法：供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。本节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。测定方法凝胶法浊度法光度测定法显色基质法.鲎试剂与内毒素反应机理内毒素C因子活化的C因子B因子活化的B因子凝固酶原凝固酶凝固蛋白原凝胶鲎凝血系统－酶联反应.名词解释1—鲎及鲎试剂鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带。鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。..名词解释2—国家标准品及工作标准品国家标准品：（单位：EU/ml）自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价；工作标准品：经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符复核、干扰试验及各种阳性对照；.名词解释3—细菌内毒素检查用水凝胶法：内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；故：灭菌注射用水≠细菌内毒素检查用水光度法：内毒素含量应小于0.005EU/ml；.细菌内毒素检测之凝胶法实验程序1、试验准备：试剂、仪器及用具2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度3、鲎试剂灵敏度复核4、供试品干扰试验（新药或新方法）5、供试品细菌内毒素凝胶法检测.实验材料及用具1、仪器名称要求天平感量0.1mg以下电热干燥箱～300℃恒温水浴箱37±1℃水银或酒精温度计～100℃±1℃漩涡混合器/计时器60min±1min2、器具器具分类器具名称反应试管玻璃试管（外径10×75mm）、试管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头其他酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、封口膜、记号笔.试剂1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号2、内毒素工作标准品3、内毒素检查用水4、75％乙醇常用英文缩写BET：细菌内毒素检查BET水：细菌内毒素检查用水MVD：供试品最大有效稀释倍数NC：阴性对照MVC：供试品最低有效浓度PC：阳性对照λ：鲎试剂灵敏度L：供试品细菌内毒素限值.灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。目的是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。试验举例：内毒素工作标准