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原核生物和真核生物目的基因的克隆并鉴定
摘要:要获得一个未知基因的功能,首先应构建其基因文库,分离目的基
因,进而表达,筛选。
关键词:基因文库;基因克隆;筛选
一真核生物目的基因的克隆并鉴定的方法
1cDNA基因文库的构建
构建cDNA基因文库主要包括以下几个步骤:细胞总RNA
的制备及mRNA的分离、cDNA第一条链的合成、cDNA与载体
的连接和噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化等。通过适当的
方法构建了一个完整的基因组DNA文库或cDNA文库,意味着包含
目的基因在内的所有基因都得以克隆,但这并不等于完成了目的
基因的分离。因为在基因文库中,不论是cDNA文库还是基因组
DNA文库,含目的基因的克隆子都只是数以万计的克隆子中的一
个,其中究竟哪一个克隆子含有我们所要研究的目的基因序列尚
不得而知。因此克隆一个基因的下一个步骤就是从基因文库中筛
选分离出含有目的基因的特定克隆子。
2目的基因的分离
目的基因的分离的方法有很多,基因芯片技术分离目的基因基
因文库技术分离目的基因,mRNA差别显示技术分离差别表达基
因,插入突变分离克隆目的基因等等。
2.1基因芯片技术分离目的基因
分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的(标)
基因。目前是通过①比较不同物种之间,或同一物种不同个体之
间;或同一个体在不同生长发育是期或不同环境条件下基因差异
表达(基因表达平行分析)来实现的。采用基因芯片技术进行基
因差异表达研究可以通过杂交直接检测到细胞中mRNA的种类
及丰度,与传统的差异显示相比具有样品用量小,自动化程度高,
被检测目标DNA密度大及并行种类多等优点。②利用同源探针
从cDNA或EST微列阵中筛选分离目的基因。目前有DNA芯片、
cDNA芯片两种。其基本步骤包括:基因芯片的制备、靶样品制
备、杂交与检测、目的基因得分离并获得全长。
2.2功能蛋白组分离目的基因
蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式,即基因组表
达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组指那些可能涉及到特定
功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过
高效液相色谱、质普对蛋白质序列进行分析,在借用分子生物学
的手段则可以进行目的基因的分离。如:应用PCR进行分离目
的基因:通过对蛋白质的序列分析,可以通过密码子的简并性设
计简并引物,可利用RT-PCR得到目的基因的全长;应用核算杂
交筛选法分离目的基因:即利用简并寡核苷酸探针筛选cDNA或
基因组文库;免疫雪筛选法分离目的基因:是通过蛋白的特异抗
体与目的蛋白的专一结合,从表达文库中分离目的基因的蛋白基
因。
3目的基因与载体连接后导入受体细胞
3.1根癌农杆菌Ti质粒介导法
农杆菌介导的Ti质粒载体转化法是目前研究最多、机制最清楚、技术
方法最成熟的基因转化途径。
3.2高压电穿孔法
利用脉冲电场将DNA导入受体细胞的方法叫做高压电穿孔法。利用
这种方法,可以将DNA导入动、植物及细菌细胞。具有简单方便、对细
胞毒性低以及转化效率高等优点。
此外还有聚乙二醇介导的原生质体转化法,磷酸钙或DEAE一葡聚糖
介导的转染,原生质体融合,脂质体法,显微注射法,颗粒轰击(particle
bombardment)技术等等。
4重组体的筛选
克隆的筛选可以根据载体类型、受体细胞特性的变化、外源
DNA分子本身的特性,采用不同的方法。主要有遗传学检测、物
理特性检测、分子杂交以及免疫学分析等。从初步筛选直到分子
杂交,进一步到DNA测序和基于蛋白质功能的分析,使得对克
隆的检测逐步深入、精确。
4.1.1抗药性筛选
这是利用载体DNA上组装的抗药性选择标记进行筛选的方法。
重组质粒DNA携带特定的抗药性基因,转化后赋予受体菌在含
有相应抗生素的培养基上正常生长,而不含此载体的DNA的受
体菌不能存活。在质粒载体中通常使用双抗药性标记。
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