未知基因的鉴定.pdfVIP

原核生物和真核生物目的基因的克隆并鉴定

摘要：要获得一个未知基因的功能，首先应构建其基因文库，分离目的基

因，进而表达，筛选。

关键词：基因文库；基因克隆；筛选

一真核生物目的基因的克隆并鉴定的方法

1cDNA基因文库的构建

构建cDNA基因文库主要包括以下几个步骤：细胞总RNA

的制备及mRNA的分离、cDNA第一条链的合成、cDNA与载体

的连接和噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化等。通过适当的

方法构建了一个完整的基因组DNA文库或cDNA文库，意味着包含

目的基因在内的所有基因都得以克隆，但这并不等于完成了目的

基因的分离。因为在基因文库中，不论是cDNA文库还是基因组

DNA文库，含目的基因的克隆子都只是数以万计的克隆子中的一

个，其中究竟哪一个克隆子含有我们所要研究的目的基因序列尚

不得而知。因此克隆一个基因的下一个步骤就是从基因文库中筛

选分离出含有目的基因的特定克隆子。

2目的基因的分离

目的基因的分离的方法有很多，基因芯片技术分离目的基因基

因文库技术分离目的基因，mRNA差别显示技术分离差别表达基

因，插入突变分离克隆目的基因等等。

2.1基因芯片技术分离目的基因

分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的（标）

基因。目前是通过①比较不同物种之间，或同一物种不同个体之

间；或同一个体在不同生长发育是期或不同环境条件下基因差异

表达（基因表达平行分析）来实现的。采用基因芯片技术进行基

因差异表达研究可以通过杂交直接检测到细胞中mRNA的种类

及丰度，与传统的差异显示相比具有样品用量小，自动化程度高，

被检测目标DNA密度大及并行种类多等优点。②利用同源探针

从cDNA或EST微列阵中筛选分离目的基因。目前有DNA芯片、

cDNA芯片两种。其基本步骤包括：基因芯片的制备、靶样品制

备、杂交与检测、目的基因得分离并获得全长。

2.2功能蛋白组分离目的基因

蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表

达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组指那些可能涉及到特定

功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过

高效液相色谱、质普对蛋白质序列进行分析，在借用分子生物学

的手段则可以进行目的基因的分离。如：应用PCR进行分离目

的基因：通过对蛋白质的序列分析，可以通过密码子的简并性设

计简并引物，可利用RT-PCR得到目的基因的全长；应用核算杂

交筛选法分离目的基因：即利用简并寡核苷酸探针筛选cDNA或

基因组文库；免疫雪筛选法分离目的基因：是通过蛋白的特异抗

体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的基因的蛋白基

因。

3目的基因与载体连接后导入受体细胞

3.1根癌农杆菌Ti质粒介导法

农杆菌介导的Ti质粒载体转化法是目前研究最多、机制最清楚、技术

方法最成熟的基因转化途径。

3.2高压电穿孔法

利用脉冲电场将DNA导入受体细胞的方法叫做高压电穿孔法。利用

这种方法，可以将DNA导入动、植物及细菌细胞。具有简单方便、对细

胞毒性低以及转化效率高等优点。

此外还有聚乙二醇介导的原生质体转化法，磷酸钙或DEAE一葡聚糖

介导的转染，原生质体融合，脂质体法，显微注射法，颗粒轰击（particle

bombardment）技术等等。

4重组体的筛选

克隆的筛选可以根据载体类型、受体细胞特性的变化、外源

DNA分子本身的特性，采用不同的方法。主要有遗传学检测、物

理特性检测、分子杂交以及免疫学分析等。从初步筛选直到分子

杂交，进一步到DNA测序和基于蛋白质功能的分析，使得对克

隆的检测逐步深入、精确。

4.1.1抗药性筛选

这是利用载体DNA上组装的抗药性选择标记进行筛选的方法。

重组质粒DNA携带特定的抗药性基因，转化后赋予受体菌在含

有相应抗生素的培养基上正常生长，而不含此载体的DNA的受

体菌不能存活。在质粒载体中通常使用双抗药性标记。