分子生物学 第七章生物分子的分离纯化.ppt

尽管碱溶液能破坏DNA中的碱基配对，但CCC质粒DNA因缠绕紧密而不易解链，只要不在碱性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋。该法操作简单、重复性好且成本低，制备的质粒纯度能满足DNA测序与PCR等实验要求，是使用最广泛的方法*质粒DNA－碱裂解法碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液*2、SDS裂解法SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。*3、煮沸裂解法该法条件剧烈，只能用于小质粒DNA的制备煮沸裂解法是将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶破坏细胞壁后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后，CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的质粒DNA。*质粒DNA的纯化1、CsCl-EB法利用CsCl形成的连续密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。2、聚乙二醇沉淀法（一种分级沉淀法）3、柱层析法（树脂）*RNA极易被RNase水解，除胞内的RNase外，它还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中；RNase分子结构中二硫键的存在使其生物学活性非常稳定，加热煮沸及一般的变性剂均不能使其完全灭活，而且去除变性剂（denaturant）后，RNase的活性又可恢复。因此，在RNA的制备过程中，排除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。真核细胞RNA的分离纯化*为获得完整的RNA分子，必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）。蛋白酶K和能与蛋白质结合的阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠，并联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。此外，在变性液中加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。*由Chomczynski和Sacchi于1987年提出。它以含4mmol/L的(异)硫氰酸胍与0.1mmol/L的β-巯基乙醇的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的酸性条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。。本法具有简便、快速、经济、高效及提取的RNA质量高等优点，能在3小时内迅速处理多个标本酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分离总RNA*mRNA的分离纯化与序列明确的rRNA、tRNA、snRNA、scRNA不同，真核生物的mRNA在细胞中含量少，种类多且分子量大小不一。除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3′末端带有长短不同的poly（A）尾巴。依据mRNA的结构特征，利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA。*1、oligo（dT）-纤维素柱层析法2、oligo（dT）-纤维素液相结合离心法3、磁性球珠分离法该法联合利用了oligo（dT）与poly（A）的互补配对、生物素（biotin）与链亲和素（streptavidin）的结合特异性以及磁性分离原理，可对poly（A）+RNA进行高效、灵敏及快捷的分离。*5′m7GAAAAAAAAAAAA3′3′TTTTTTTTTTTT-Biotin5′+总RNA中的poly(A)+RNA分子退火形成杂交体5′m7GAAAAAAAAAAAA3′3′TTTTTTTTTTTT-Biotin5′链亲和素标记的磁珠+Streptavidin-磁5′m7GAAAAAAAAAAAA3′3′TTTTTTTTTTTT-Biotin5′Streptavidin-磁生物素与链亲和素的特异性结合磁性分离5′m7G