微生物挑战性实验方法.docx

微生物挑战性试验方法

1.0目的

产品防腐效果的测试

2.0范围公司产品

3.0参考：

4材料与方法

4.1 扮装品中常用的防腐体系[6]

养分琼脂培育基、改进马丁琼脂培育基、养分肉汤培育基、

0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培育箱等

4.2 微生物挑战性试验

4.2.1 受试用微生物

测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所供给。细菌包括:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括:黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。

试验前，将各菌种接种于适宜的培育基中,于37℃(细菌)或28℃(霉菌)下培育。细菌培育在2天后,霉菌培育在3-5天后，选择适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成确定浓度的混合细菌(1×108个/ml)或混合霉菌悬液(1×107个/ml),置于4℃贮放备用。

4.2.2一次加菌的28天微生物挑战试验

此方法参照美国药典(第21版)上微生物挑战性

试验检测防腐剂效果的方法。称取各受试样品30g,参与混合细菌或混合霉菌悬液,每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3×105个霉菌。然后

充分混匀,置于28℃下。在接菌的0、7、14、21和28天取样分析:准确称取3g样品,加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内,参与27ml灭菌生理盐水,充分震荡混匀,此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌量,细菌培育是37℃下24h～48h，霉菌培育为28℃下3～5天。此试验用以评判防腐剂的有效与否。评判标准为:当每克样品中一次接菌(1×106细菌和1×105霉菌)后,在第14天存活菌量削减至不高于起始浓度的0.1%,以后渐渐削减,在28天为0。符合标准为防腐剂有效(通过测试),不符合为防腐剂无效(不通过测试)。

分析与检测

4.2.3 重复3次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CTFA〔国际扮装品、香精和洗涤剂协会〕推举的微生物挑战性试验。称取受试样品30g,每隔

2周加菌一次(即试验的第1、3和5周),每次加细菌量为1×106～1×107

个/g样品和霉菌1×105个/g～1×106个/g 样品。在加菌后的0天、7天和

14天(后一次加菌前)采样分析样品中含菌量,方法同前。此方法可将受检样品分为三类:

(1)防腐效果优良(W),即三次加菌后,在每次加菌后的第7天或14天时,存活菌量削减至不高于起始浓度的0.01%(即≤100个/g或ml〕样品,通过测试)。

(2)防腐效果尚可(M),即三次加菌后,在每次加菌后的第7天或14天时,存活菌量削减至不高于起始浓度的0.1%,(即≤1000个/g或mL样品,通过测试)。

(3)防腐效果差(P),即三次加菌后,在每次加菌后的第7天或14天时,存活菌量mL样品(不通过测试)。

5、结果推断

受试样品一次加菌和3次加菌后,在检测时间内细菌和霉菌的抗腐力气见表1～4。依据两种方法评判标准,将8种防腐体系的防腐效果评判列于表5。从结果看,两种加菌方法对防腐体系的评判结果根本全都,三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区分:防腐优良(W:We preservative)和防腐尚可

(M:Marginapreservative)。此外,在一次加菌后1～2周内能将样品中含菌量降低至参与菌量的0.1%,可通过3次加菌试验,如防腐体系5和8对细菌

的防腐力

的防腐力;但假设大于0.1%,即使在以后的测试时间内有渐渐下降至0的趋势,可能亦很难通过3次加菌试验,如防腐体系7对细菌的防腐力。

参照美国扮装品、香精和洗涤剂协会〔CTFA〕推举的菌种〔因其较具代表性，如表2所示〕

(留意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同〕

2.3试验用菌液的配置

标准悬液的配制

1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3

倍稀释。

细菌菌悬液的配制

试验前将菌株接种到各个培育基斜面上，36摄氏度恒温培育48小时。将已培育好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度〔3×108cfu/